NU7026對人肝癌細胞HepG2生物學行為的影響

(南華大學公共衛生學院，湖南省衡陽市 421001)

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2015年中國肝癌發病人數為37.0萬人，發病率為26.92/10萬，死亡人數32.6萬，死亡率23.72/10萬[1]。原發性肝癌發病隱匿，病程短，發展迅速，當前主要治療手段有手術切除、放射治療、藥物治療、肝移植等。但肝癌易復發、易轉移，預后差，且對放化療具有抵抗性，尋求治療肝癌的藥物具有重要意義。

原發性肝癌中最常見的肝癌組織類型是肝細胞癌[2]。本文探討了NU7026抑制DNA-PKcs對肝癌細胞的增殖、遷移能力的影響，為治療肝癌提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細胞(HepG2)由軍事科學醫學院周平坤研究員惠贈。HepG2細胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培養基(Gibco)，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。NU7026(LY293646，C17H15NO3)購于MCE公司，純度為99.95%。細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 CCK8實驗

取處于指數生長期的 HepG2 細胞，用含 10%胎牛血清的培養液配成單個細胞懸液接種于 96 孔板中，加入適量的細胞懸液(約7 000～8 000個/孔)，待細胞貼壁后，分別用5、10、15、20 μmol/L NU7026進行處理，設3個復孔，繼續培養 24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，孵育1 h，用酶聯免疫檢測儀測定 450 nm 波長處的光密度值(OD)，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(空白組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.3 生長曲線實驗

按2×104個/孔細胞接種于6孔細胞培養板，10 μmol/L NU7026處理細胞每組設3個復孔，每隔24 h計數1次，連續計數3天，以時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制生長曲線圖。

1.4 克隆實驗

將細胞接種于6 cm細胞培養皿，10 μmol/L NU7026處理細胞，10天后棄掉培養基，PBS洗2遍，加入固定液3 mL，固定30 min；再加入3 mL Giemsa染色30 min，最后用流水緩慢沖洗，晾干。計數含50個細胞以上的克隆數，克隆形成率(%)=克隆數/[實驗組接種細胞數×(對照組克隆數/對照組接種細胞數)]×100%。

1.5 劃痕實驗

將細胞接種在6孔細胞培養板中，細胞貼壁后用200 μL無菌的槍頭尖端在每孔相同位置做線性劃痕，再用PBS輕輕沖洗2～3遍，10 μmol/L NU7026處理細胞，分別在0、24、48、72 h后于顯微鏡下拍照觀察劃痕，采用Image J 軟件觀察計算細胞劃痕面積，面積愈合率(%)=(0 h劃痕面積-培養后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 細胞凋亡與細胞周期試驗

將細胞接種于6孔細胞培養板，10 μmol/L NU7026處理細胞，按照說明書步驟進行，1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。取適量HepG2細胞接種于6 cm細胞培養皿中，用10 μmol/L NU7026處理0、4、8、12、24 h后收樣。按照說明書步驟進行，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 不同濃度NU7026對HepG2細胞活性的影響

隨著NU7026濃度的增加，HepG2細胞存活率下降。與0 μmol/L組和DMSO組比較，15 μmol/L和20 μmol/L NU7026作用HepG2細胞后，細胞存活率下降(P<0.05；圖1)；10 μmol/L NU7026作用HepG2細胞24、48、72 h后，與DMSO組細胞存活率比較，差異有顯著性(P<0.05)，與0 μmol/L 組細胞存活率比較，差異無顯著性(P>0.05)；查閱文獻[3]及根據前期研究[4]，本研究中10 μmol/L NU7026對HepG2細胞沒有明顯的毒性作用，故選擇10 μmol/L NU7026進行后續實驗。將實驗分為空白組、對照組(0.1%DMSO)和NU7026組(10 μmol/L NU7026)。

圖1 CCK8檢測不同濃度NU7026對HepG2細胞活性的影響a為P<0.05，與0 μmol/L組比較；b為P<0.05，與DMSO組比較。

2.2 各組HepG2細胞增殖能力比較

NU7026作用HepG2細胞72 h 后，NU7026組細胞數明顯低于對照組(P<0.05；圖2)；NU7026組細胞克隆數少于對照組，克隆形成率明顯降低(P<0.05；圖2)。

圖2 各組HepG2細胞增殖能力的比較A為培養10天后克隆實驗細胞分布圖(Giemsa染色)和柱狀圖；B為細胞生長曲線圖。 a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

2.3 各組HepG2細胞遷移能力

NU7026作用細胞24 h后，與對照組相比，面積愈合率無明顯差異(P>0.05)；NU7026作用細胞48 h后，劃痕面積比對照組稍大，面積愈合率無明顯差異(P>0.05)；但在作用72 h后，NU7026組劃痕面積大于對照組，面積愈合率明顯降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組HepG2細胞遷移能力比較A為細胞劃痕實驗遷移(200×)；B為細胞劃痕愈合率折線圖。a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

2.4 各組HepG2細胞的凋亡與周期

NU7026作用HepG2細胞24、48、72 h后，細胞凋亡率增加(P<0.05；圖4)。隨著NU7026作用時間增加，HepG2細胞凋亡率逐漸增加。NU7026作用HepG2細胞12 h后，出現了輕微的G2/M阻滯現象，但細胞周期未出現明顯改變(圖5)。

圖4 各組HepG2細胞凋亡比較A為細胞凋亡圖；B為細胞凋亡率柱狀圖。a為P<0.05，與空白組比較；b為P<0.05，與對照組比較。

圖5 各組HepG2細胞周期的比較A為流式細胞術檢測細胞周期圖；B為細胞周期占比圖。

3 討 論

肝癌在全球惡性腫瘤發病譜中排第六，其中中國肝癌新發病例數將近占全球發病的一半[5]。DNA-PKcs是一種相對分子質量約為470 kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與共濟失調毛細血管擴張癥基因(Ataxia telangiectasia mutated，ATM)、RAD3相關蛋白(Ataxia telangiectasiaand Rad3-related protein，ATR)同屬于磷酸酰肌醇3-激酶相關蛋白激酶(PIKK)家族。DNA-PKcs和ATM在DNA雙鏈斷裂修復中起著重要的作用，ATR主要參與DNA單鏈斷裂修復。DNA-PKcs不僅參與淋巴細胞的V(D)J重組和類別轉換重組，保護染色體末端，而且DNA-PKcs響應胰島素信號傳導，促進肝臟中碳水化合物轉化為脂肪酸[6-7]。

DNA-PKcs抑制劑有渥曼青霉素、NU7441、NU7026、IC化合物等。NU7026對DNA-PKcs抑制性特異度高，能有效抑制DNA-PKcs Ser2056磷酸化[4]。本研究通過生長曲線實驗和克隆實驗檢測細胞增殖能力，表明NU7026抑制DNA-PKcs將降低HepG2細胞增殖能力，與其他研究結果相一致。用siRNA介導肝癌HepG2細胞中DNA-PKcs沉默，細胞增殖速度減慢，且高表達DNA-PKcs可通過AKT/GSK3/c-myc信號通路調節肝癌細胞增殖[8]。同樣用siDNA-PKcs轉染肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu后，細胞增殖能力降低，可能抑制DNA-PKcs后胸腺嘧啶合成酶(TS)表達下降，從而抑制DNA合成，細胞增殖生長變慢[9]。但也有研究表明NU7441抑制DNA-PKcs促進肺成纖維細胞中SSEA4+間充質祖細胞增殖[10]。沉默DNA-PKcs不僅抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖，而且也抑制細胞遷移和侵襲[11]。

本文結果顯示抑制DNA-PKcs能降低HepG2細胞遷移能力。有研究表明將沉默DNA-PKcs的HepG2細胞移植到裸鼠中，其腫瘤生成率明顯降低[8]。DNA-PKcs通過RhoA/ROCk2通路調節基質金屬蛋白酶-2和磷酸化肌球蛋白輕鏈 2表達，促進體內外骨肉瘤細胞遷移和侵襲[12]。也有研究發現ITGA5和SDC4基因與DNA-PKcs可能對細胞遷移侵襲運動具有互相調節作用[13]。

本研究用NU7026抑制DNA-PKcs 24、48、72 h，HepG2細胞凋亡增加，與其他研究結果一致。有研究表明沉默DNA-PKcs后，通過線粒體凋亡途徑促進肝癌耐藥細胞Bel-7402/5-Fu凋亡[14]。也有研究表明沉默DNA-PKcs后，有絲分裂細胞紡錘體異常，胞質分裂失敗，有絲分裂延長等，最終導致細胞有絲分裂災變而凋亡[15]。

用TDR將HeLa細胞同步化至G1期后釋放，沉默DNA-PKcs的HeLa細胞在6 h出現明顯的G2/M期阻滯，表明抑制DNA-PKcs會引起G2/M期阻滯[16]。用nocodazole同步化細胞后釋放，抑制HeLa細胞DNA-PKcs，H3-pS10陽性細胞增加，表明細胞阻滯在有絲分裂期[17]。也有研究表明沉默MG-63細胞DNA-PKcs 48 h，細胞周期無明顯改變[11]。在本研究中NU7026抑制DNA-PKcs對HepG2細胞周期無明顯改變，可能是因為細胞DNA損傷不嚴重，DNA修復時間較短，細胞能較快地通過周期檢查點，故未出現明顯G2/M期阻滯。

綜上所述，NU7026能抑制HepG2細胞增殖能力和遷移能力，其機制可能與促進細胞凋亡有關。