不育男性Y染色體微缺失與輔助生殖助孕結(jié)局的關(guān)系*

侯建華，馬玉珍，孫文芳，陳紅，任宇（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，呼和浩特010051）

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，育齡期夫婦中不孕不育比率約為10%～15%，男性因素占30%～50%［1］，其中由染色體所致的遺傳因素約占男性因素的30%［2-3］，是男性不育癥的重要因素之一。Y染色體微缺失已經(jīng)成為繼克氏綜合征后的又一大男性不育的遺傳學(xué)因素［4］，受到越來(lái)越多的關(guān)注、重視和深入研究。輔助生殖技術(shù)作為治療不育癥的重要手段之一，已日益成熟并廣泛應(yīng)用。但該技術(shù)在成功幫助不育夫婦實(shí)現(xiàn)生育后代的同時(shí)，也在很大程度上將某些遺傳性不育的基因垂直傳遞給了后代，所以在決定采用輔助生殖助孕技術(shù)之前，對(duì)不育患者進(jìn)行染色體等遺傳學(xué)檢測(cè)非常必要。1976年Tiepolo等［5］首次發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥與Y染色體長(zhǎng)臂上的微缺失有關(guān)，推測(cè)與Y染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶（Yq11）的精子生成基因或無(wú)精子因子（azoospermia factor，AZF）基因家族相關(guān)［6-7］。Dohle等［8］對(duì)原發(fā)性無(wú)精子癥和少精子癥患者分析發(fā)現(xiàn)，存在Y染色體AZF的微缺失，提示AZF微缺失可能是造成男性原發(fā)性不育的重要遺傳因素之一，AZF基因片段的丟失可能造成生精障礙。研究證實(shí)［9-10］，Y染色體長(zhǎng)臂（Yq）AZF a、b和c區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)部位出現(xiàn)缺失時(shí)，將會(huì)造成精子發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致少精子癥甚至無(wú)精子癥的發(fā)生，從而影響男性生育能力。本研究探討不育男性Y染色體微缺失與輔助生殖助孕結(jié)局的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年5月至2020年12月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的進(jìn)行染色體檢查及Y染色體微缺失檢測(cè)的346例少精子或無(wú)精子的男性不育癥患者，分為3組：A組為無(wú)精子癥組（105例），年齡（33.5±3.9）歲；B組為重度少精子癥組（75例），年齡（34.1±4.1）歲；C組為輕、中度少精子癥組（166例），年齡（34.2±4.3）歲。3組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。排除女方子宮內(nèi)膜及卵子因素（子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫、多囊卵巢綜合征等），僅納入男方精子因素及女方輸卵管因素的94例患者進(jìn)行體外受精（IVF）/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕治療。

1.2 主要儀器與試劑 外周血DNA柱式小量提取試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技公司，Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海透景生命科技公司。根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)（European Academy of Andrology，EAA）、歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控網(wǎng)（European Mo-lecular Genetics Quality Network，EMQN）2013版推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)。該試劑盒采用2管多重PCR擴(kuò)增、4個(gè)通道［（羧基熒光素（FAM）/綠 色 熒 光蛋白（VIC）/羧基-X-羅丹明（ROX）/花菁素（Cy5）］熒光檢測(cè)的方法，判斷AZF a、b、c區(qū)域6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tag site，STS）的微缺失，同時(shí)設(shè)置2個(gè)內(nèi)對(duì)照基因：男性性別決定基因（sex-determining region of the Y chromosome，SRY）和編碼鋅指蛋白基因ZFX（zinc finger protein，X-linked）/ZFY（zinc finger protein，Ylinked），對(duì)標(biāo)本采集、抽提、PCR整個(gè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。

1.3 方法

1.3.1 精液常規(guī)檢查 根據(jù)《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）的標(biāo)準(zhǔn)［11］，用SSA-Ⅱ精子自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)（穗加軟件公司）檢測(cè)。按WHO規(guī)定，至少2次常規(guī)檢查無(wú)精子，離心沉淀后仍未見(jiàn)精子的診斷為無(wú)精子癥。精子濃度＜5×106/mL為重度少精子癥；5×106/mL≤精子濃度＜10×106/mL為中度少精子癥；10×106/mL≤精子濃度＜15×106/mL為輕度少精子癥。

1.3.2 Y染色體微缺失檢測(cè) 采用外周血DNA柱式小量提取試劑盒提取外周血DNA，采用Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒及熒光PCR儀進(jìn)行Y染色體微缺失的檢測(cè)。

1.3.2.1 DNA提取 按照外周血DNA柱式小量提取試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)提取外周血DNA。取200μL外周血加入蛋白酶K及裂解緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解，再加入無(wú)水乙醇離心漂洗沉淀提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增 采用25μL反應(yīng)體系，包括22.5μL a組或b組PCR預(yù)混液，2.5μL核酸樣本或陰性對(duì)照或質(zhì)控品。PCR反應(yīng)條件：第1階段為50℃2 min，1個(gè)循環(huán)；第2階段為95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；第3階段為95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，38個(gè)循環(huán)；第4階段為72℃5 min，1個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：在第3階段60℃時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號(hào)，并保存相關(guān)文件。

1.3.2.3 結(jié)果判讀 見(jiàn)表1。

表1 Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果判讀說(shuō)明

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。結(jié)果以率（%）表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別Y染色體微缺失結(jié)果的比較 346例男性不育癥患者中共檢出AZF微缺失17例，總?cè)笔蕿?.91%（17/346）。在105例無(wú)精子癥組（A組）中有9例微缺失，其中5例為AZF c區(qū)缺失，2例為AZF b區(qū)缺失，1例為AZF b+c區(qū)缺失，1例為AZF a+b+c區(qū)全部缺失，其中2例2～3個(gè)AZF區(qū)域同時(shí)缺失的患者又進(jìn)行再次抽血復(fù)查，結(jié)果與原結(jié)果一致；75例重度少精子癥組（B組）中有6例微缺失，均為AZF c區(qū)缺失；166例輕、中度少精子癥組（C組）中有2例微缺失，均為AZF c區(qū)缺失，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，A組的缺失率（8.57%，9/105）、B組的缺失率（8.00%，6/75）高于C組的缺失率（1.26%，2/166），χ2分別為5.466、7.171，P均＜0.05；但A組與B組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2為0.242，P＞0.05）。

表2 不同組別Y染色體微缺失種類(lèi)分布及缺失率的比較

2.2 有無(wú)Y染色體微缺失患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較 17例Y染色體微缺失患者中有4例無(wú)精子癥患者為生精功能障礙型，通過(guò)睪丸/附睪穿刺均未找到精子，4例通過(guò)精漿果糖及生殖激素等輔助檢測(cè)判斷為非梗阻性無(wú)精子癥，以上8例均未行助孕治療，其余9例Y染色體微缺失患者均進(jìn)行了IVF/ICSI助孕治療。本研究入組的94例進(jìn)行助孕的夫婦，不孕原因女方排除排卵障礙、卵巢功能早衰、子宮內(nèi)膜因素等，只有輸卵管因素，其余均為男方嚴(yán)重少精子或無(wú)精子癥因素。有Y染色體微缺失患者與無(wú)Y染色體微缺失患者IVF/ICSI妊娠結(jié)局比較見(jiàn)表3，兩組妊娠率及活產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

3 討論

本研究選取由EAA及EMQN推薦的AZF a（sY84、sY86）、b（sY127、sY134）及c（sY254、sY255）3個(gè)區(qū)域6個(gè)位點(diǎn)的基因缺失進(jìn)行分析，研究其與嚴(yán)重少精子癥及無(wú)精子癥的關(guān)系，這也是目前對(duì)于男性不育癥診斷和治療的共識(shí)［12-13］。結(jié)果顯示，346例進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)的患者中共計(jì)17例存在Y染色體微缺失，總?cè)笔蕿?.91%。按照精子質(zhì)量的嚴(yán)重程度分成無(wú)精子癥（A）組、重度少精子癥（B）組及輕、中度少精子癥（C）組，其Y染色體微缺失率分別為8.57%、8.00%和1.26%，A組和B組的Y染色體微缺失率均高于C組（P均＜0.05），但A組與B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。國(guó)內(nèi)許多生殖中心也有關(guān)于無(wú)精子癥、少精子癥相關(guān)Y染色體微缺失發(fā)生的報(bào)道，但結(jié)果變異較大［14-16］。

隨著輔助生殖技術(shù)的蓬勃發(fā)展，IVF/ICSI技術(shù)用于治療男性不育已廣為接受。Y染色體微缺失是否會(huì)影響IVF/ICSI的治療結(jié)局，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道不多且結(jié)果不一、尚存爭(zhēng)議。本研究346例中的94例進(jìn)行了IVF/ICSI助孕治療，結(jié)果顯示Y染色體微缺失組與無(wú)缺失組相比，臨床妊娠率及活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究顯示［17-18］，Y染色體微缺失可能與流產(chǎn)有關(guān)，尤其是AZF c區(qū)缺失。但由于本研究Y染色體微缺失組樣本量小，比較結(jié)果可能存在偏差，還有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的研究。因Y染色體微缺失患者未行植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）技術(shù)進(jìn)行性別篩選，也就存在將微缺失垂直傳遞給子代男嬰以及將來(lái)男嬰成人后依舊面臨Y染色體微缺失乃至不育的風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)論與國(guó)內(nèi)外大部分文獻(xiàn)報(bào)道相一致［19-20］。

Y染色體微缺失能夠引起生精功能障礙造成少、弱精子癥甚至無(wú)精子癥，繼而造成男性不育癥的發(fā)生，但同時(shí)這種缺失不會(huì)傳遞給子代。而隨著ICSI技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展，由Y染色體微缺失引起的少精子癥及無(wú)精子癥均可以通過(guò)ICSI技術(shù)獲得自己的子代，若獲得的子代為男嬰，這種微缺失就會(huì)垂直傳遞給子代，甚至有研究顯示這種微缺失在男性子代成長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)擴(kuò)大缺失片段，造成子代男性延續(xù)不育現(xiàn)象。為了避免此類(lèi)情況的發(fā)生，就需要對(duì)該類(lèi)微缺失患者進(jìn)行PGD技術(shù)，俗稱(chēng)“三代試管嬰兒”，它能夠在胚胎植入母體前對(duì)胚胎進(jìn)行篩選，選擇沒(méi)有Y染色體的胚胎，這樣得到的女性后代就可以成功阻斷微缺失的繼續(xù)遺傳。對(duì)于男方有Y染色體微缺失欲行ICSI助孕的夫婦，需告知若為男性后代成年后同樣面臨生育問(wèn)題，但不影響健康［21］。經(jīng)過(guò)充分的遺傳咨詢，絕大部分夫婦仍然選擇行常規(guī)ICSI，理論上生育男性后代的概率為50%，少部分夫婦選擇PGD挑選女性胚胎移植或供精人工授精。但對(duì)這類(lèi)患者是否需要行PGD一直以來(lái)備受爭(zhēng)議，因?yàn)镻GD技術(shù)不僅費(fèi)用昂貴，且有可能無(wú)法篩選出合適的胚胎，這樣的結(jié)果往往讓患者難以接受。這也是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于PGD這項(xiàng)技術(shù)爭(zhēng)論的焦點(diǎn)之一。