糖尿病腎病患者血清人巨細胞病毒miR-US4-3p水平變化及價值*

王萍萍，王成，王靜，張明超，張春妮，張辰宇，汪俊軍（.南方醫科大學第一臨床醫學院&東部戰區總醫院臨床檢驗科，南京000；.東部戰區總醫院國家腎臟疾病臨床醫學研究中心全軍腎臟病研究所，南京000；.南京大學生命科學學院，南京0046）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）晚期主要微血管并發癥，也是終末期腎病的主要病因［1］，但其發病機制尚不明確。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種具有囊膜包被的線性雙鏈DNA病毒，其基因組大小為220～240 kb，可在新生兒和免疫功能低下的個體中引起較高的發病率和死亡率，是目前發現的唯一可產生miRNA的β皰疹病毒，HCMV能夠編碼26個成熟miRNA［2］。越來越多的證據顯示，HCMV編碼的miRNA可調節各種生物過程，包括病毒復制、潛伏感染、免疫逃逸和宿主細胞周期［3-5］。有報道顯示，原發性高血壓患者血漿中hcmv-miR-UL112表達較健康對照者明顯上調，提示HCMV編碼miRNA可能是介導HCMV感染導致血管損傷和血壓升高的關鍵因子［6］。在2型糖尿病（T2DM）、膠質母細胞瘤及口腔扁平苔蘚患者外周血中也觀察到HCMV miRNA的高表達［7-8］，提示循環中HCMV編碼miRNA是一類潛在的新型疾病生物標志物。研究證實，HCMV miR-US4-3p靶向內質網氨肽酶ERAP1，ERAP1功能的變化或喪失會改變組織相容性復合體（MHC）Ⅰ分子呈遞的抗原組成從而影響NK細胞和CD8+T細胞的激活，導致免疫應答缺陷和疾病的發生［9-10］。DN的發生發展與炎癥和免疫反應有關［11］，我們推測miR-US4-3p與DN之間可能存在關聯，目前關于miR-US4-3p在DN患者中的表達變化及其臨床價值研究未見報道。因此，本研究通過qRT-PCR方法檢測DN患者、單純DM患者和健康對照者中血清miR-US4-3p的表達，以探討其在DN中的潛在臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2020年1月于中國人民解放軍東部戰區總醫院（原南京軍區總醫院）確診的T2DM患者128例，所有患者均符合T2DM診斷標準［12］。其中T2DM患者（DM組）64例，DN患者（DN組）64例。DM組男性48例，女性16例，年齡（55.92±17.46）歲，DM病程［3（0.08，7）］年；DN組男性42例，女性22例，年齡（55.78±11.88）歲，DM病程［10（5，16）］年。DN診斷標準患者符合下列任何一項者：①大量清蛋白尿；②糖尿病視網膜病變伴微量蛋白尿；③腎臟穿刺活檢符合DN病理表現，即診斷為DN［13］。選取同期健康體檢者64例作為對照組，男性42例，女性22例，平均年齡（53.20±10.74）歲。排除標準為：其他急慢性腎病、繼發性糖尿病、心臟與肝臟等全身疾病引發的腎臟疾病、創傷、急性感染、惡性腫瘤和自身免疫病者。各組性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲中國人民解放軍東部戰區總醫院倫理委員會批準許可（批準文號：2018NZGKJ-096），研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 D10糖化血紅蛋白檢測儀（美國Bio-Rad公司）；7600型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；Cobas e601型全自動電化學發光免疫分析儀（瑞士Roche公司）；5418型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；SAS67120型超純水儀（美國Millipore公司）；2720型PCR儀（美國ABI公司）；LightCycler?96實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

RNA提取試劑即酸性水飽和酚（北京索萊寶公司）；分析純級氯仿、異丙醇、無水乙醇（上海國藥集團試劑公司）；人工合成的peu-MIR2911成熟體（上海Invitrogen公司）；miRNA逆轉錄引物及Taq-Man探針（美國ABI公司）（peu-miR2911貨號：242025_mat；hcmv-miR-US4-3p貨號：469699_mat）；逆轉錄體系和qRT-PCR體系所用試劑（大連TaKa-Ra公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑及校準品購自英國Randox公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑及校準品購自日本第一化學株式會社；糖化血紅蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c）檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cystatin C，Cys C）檢測試劑盒購自寧波普瑞柏生物技術公司；空腹血糖（FPG）檢測試劑盒購自富士膠片和光純耀（上海）化學公司；肌酐（creatinine，Cr）檢測試劑盒購自四川maccura生物公司；甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）試劑及校準品購自瑞士Roche公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集與處理 采集研究對象清晨空腹狀態下靜脈血3～5 mL，離心后獲取上層血清液，于-80℃保存，用于miRNA和生化指標的檢測。

1.3.2 血清HCMV miRNA表達的檢測 基于Taq-Man探針的qRT-PCR方法檢測血清miR-US4-3p（5′-UGACAGCCCGCUACACCUCU-3′）的 水 平。首先，取單個血清樣本100μL，總RNA提取采用酸性苯酚-氯仿一步法進行抽提［14］，每個血清樣品在提取過程中均加入20μL人工合成的濃度為107fmol/L的植物MIR2911（5′-GGCCGGGGGACGGGC UGGGA-3′）成熟體作為外源性參照，用于校正RNA提取效率和誤差，提取后的總RNA溶于22μL DEPC水。

血清RNA逆轉錄PCR反應體系為10μL：DEPC水3.5μL、5×AMV緩沖液2μL、dNTPs 1 μL、逆轉錄引物1μL、AMV逆轉錄酶0.5μL、RNA樣品2.0μL。反應條件參數為：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min，每個反應均為1個循環。逆轉錄所得cDNA凍存于-20℃。

qRT-PCR反應體系為20μL：ddH2O 14.77μL、10×PCR緩沖液2μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、dNTPs 0.4μL、Taq聚合酶0.3μL、miRNA檢測探針0.33μL、cDNA 1μL。反應條件參數為：95℃5 min，1個循環；95℃15 s，60℃1 min，共40個循環。

實驗結果采用2-ΔCt方式計算miR-US4-3p的相對表達量，ΔCt=Ct目的miRNA-CtMIR2911。每個Ct值為相應樣品重復測定3次后所得均值，同時以不含RNA的模板的ddH2O水作為陰性對照。

1.4 統計學分析 采用SPSS20.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗數據分布的正態性。正態分布資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差非齊性時采用Tamhane′s T2檢驗。非正態分布資料采用中位數（第25百分位數，第75百分位數）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-wallis H秩和檢驗。計數資料采用百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗。變量間相關性分析采用Spearman相關分析。采用ROC曲線和Logistic回歸分析血清miR-US4-3p水平對DN預測和區分價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般資料 對DN、DM和對照組患者的一般資料進行單因素方差分析，結果顯示，3組患者的DM病程、HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C、Cr和Cys C差異均有統計學意義（P均＜0.05）。對差異有統計學意義的指標進行兩兩比較，結果顯示DN組和對照組間，HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C和Cre差異均有統計學意義（P均＜0.05）。DN組與DM組相比，糖尿病病程、HbA1c、LDL-C、Cre和Cys C差異均有統計學意義（P均＜0.05）。DM組與對照組相比，HbA1c、FPG、TG、HDL-C差異均有統計學意義（P均＜0.05）。而各組研究對象性別、年齡等比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 3組研究對象臨床基本資料比較

2.2 各組血清miR-US4-3p表達水平比較 qRT- PCR結果顯示，與對照組及DM組相比，DN組患者血清miR-US4-3p的表達水平升高（P＜0.001），而DM組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血清miR-US4-3p表達水平比較

2.3 血清miR-US4-3p與DN患者臨床指標之間的相關性分析 Spearman相關性分析顯示，DN患者血清miR-US4-3p與Cys C（r=0.288，P=0.023）、PTH（r=0.493，P=0.045）呈正相關，與eGFR呈負相關（r=-0.280，P=0.026），而與HbA1c（r=-0.127，P=0.342）、FPG（r=0.028，P=0.826）、TG（r=0.032，P=0.803）、TC（r=0.135，P=0.288）、LDL-C（r=0.062，P=0.629）、HDL-C（r=-0.103，P=0.468）、Cr（r=0.245，P=0.053）、糖尿病病程（r=-0.053，P=0.699）不相關。

2.4 血清miR-US4-3p對DN的預測及區分價值 ROC曲線分析顯示，miR-US4-3p能夠較好區分DN患者和健康對照者，其ROC曲線下面積（areas under the ROC curve，AUC）為0.792（95%CI：0.715～0.869），見圖1A。當cut-off值為0.011時，miR-US4-3p診斷DN的敏感性為71.9%，特異性為73.4%。此外，miR-US4-3p在鑒別DM和DN的AUC為0.748（95%CI：0.664～0.832），見圖1B。在cut-off值為0.012時，其敏感性為71.9%，特異性為64.1%。

圖1 miR-US4-3p對DN預測和區分的ROC曲線

Logistic回歸單因素模型中僅納入血清miRUS4-3p分析，結果顯示：以對照組為參考類別，高血清miR-US4-3p水平與DN的發生相關（OR=7.065，95%CI=3.247～15.376，P＜0.001）；以DM組為參考類別，血清miR-US4-3p水平的升高還可區分DN和DM（OR=4.879，95%CI=2.304～10.332，P＜0.001）。多因素模型中除了納入血清miR-US4-3p外，還同時納入年齡、性別及血脂指標（TG、TC、LDL-C、HDL-C），結果顯示，在校正年齡、性別及其他血脂水平影響后，血清miR-US4-3p水平的升高仍與DN的發生密切相關（OR=7.236，95%CI=2.633～19.889，P＜0.001），對DN和DM的區分仍具有統計學意義（OR=6.466，95%CI=2.778～15.052，P＜0.001）。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析血清miR-US4-3p水平對DN的預測及區分價值

3 討論

DN約占DM患者的40%，但其發病機制尚未明確。既往研究已證實，多種miRNAs參與腎小管上皮細胞氧化應激反應、糖代謝紊亂、腎纖維化、系膜細胞肥大的病理過程［15］。病原微生物與人類疾病的關系日益受到重視，諸多證據表明HCMV感染與炎癥反應激活、血管重塑相關，HCMV利用自身編碼的miRNAs調節自身及宿主細胞的基因差異表達可進一步完成免疫逃避、細胞進程調節、病毒DNA復制以及對細胞凋亡的調節功能。HCMV miRNAs的研究可為進一步了解病毒致病機制和宿主防御機制提供線索。Pan等［16］研究表明，血清HCMV miR-US4-1可作為預測干擾素α治療慢性乙型肝炎患者療效新的生物標志物，提示檢測HCMV miRNA的變化在疾病中具有重要意義。然而，HCMV miRNA與DN之間的聯系尚未得到闡明。本研究發現，DN患者血清HCMV miR-US4-3p的表達顯著高于健康人群和DM患者，而DM患者與健康人群間的表達差異無統計學意義，進一步多因素Logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、性別、其他血脂指標影響后，血清高miR-US4-3p是DN發生的危險指標，且對DN和DM患者的鑒別具有意義，提示血清miR-US4-3p有望成為DN發病的輔助診斷指標及DN與DM間潛在的鑒別指標。

研究顯示，免疫及炎癥反應在DN發病機制中發 揮 重 要 作 用［11］。Kim 等［9］報 道，HCMV miR-US4-1可調控ERAP1 mRNA的翻譯水平，從而極大地降低抗原的呈遞，逃逸宿主對其的監控和免疫。Huang等［5］研究表明，hcmv-miR-UL112通過下調Ⅰ型IFN信號傳導抑制NK細胞的細胞毒性來破壞先天免疫，表明HCMV可以利用基于miRNA的免疫逃逸機制。既往研究證實，HCMV感染導致細胞轉錄因子NF-κB的激活［17］，而高血糖導致糖基化終產物增多，可通過NF-κB信號通路誘導巨噬細胞遷移并釋放炎癥細胞因子TNF-α及IL-1β，NF-κB活化可刺激趨化因子和黏附分子的轉錄。近年來研究證實內皮功能障礙對腎小球疾病的發生、發展有著重要影響，腎小球內皮細胞通過與系膜細胞及足細胞的交流可進一步促進DN發展。Shen等［18］研究發現，HCMV miR-UL112可通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路、細胞黏附分子、趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用等途徑誘導血管細胞（如內皮細胞、平滑肌細胞）功能障礙，導致血管損傷；miR-UL112還可通過調控ACE2基因在腎臟中的表達，影響腎素血管緊張素系統從而調控機體血壓水平［19］。因此，我們推測miR-US4-3p可能參與調節DN的免疫逃避及炎癥反應進程，并通過誘導血管內皮功能障礙，使足細胞、系膜細胞發生改變，進一步加重DN發展。本研究中相關分析證實血清miR-US4-3p的表達與Cys C、PTH顯著正相關，Cys C不受性別、年齡等因素影響，并且腎臟是其唯一清除器官，能夠靈敏反映腎臟損傷程度［20］；DN時由于患者腎小球通透性增強，血鈣丟失刺激PTH分泌增多，因此PTH的檢測也可作為判定早期腎臟損傷的預警指標之一。以上研究均提示miR-US4-3p參與DN發展進程。

研究發現，細胞外囊泡（EVs）中富含miRNA，并能保護其不被降解［21］。越來越多的證據表明，EVs通過細胞與細胞之間的交流在病毒感染中起著重要作用。已經發現病毒感染可以改變宿主細胞中EVs miRNA的表達，Zhang等［2］通過深度測序分析人類胚胎肺成纖維細胞（HELF）中EVs miRNA發現，EVs中miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p在感染后6 h水平升高，HCMV感染嬰兒血清EVs miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p的水平與肝損害密切相關。從Zhang等［2］結果中發現，感染細胞可釋放更多的EVs，HCMV miRNA可以通過EVs轉運至受體細胞發揮作用。Ding等［22］發現，在HCMV潛伏期，口腔扁平苔蘚病患者血漿樣本中hcmv-miR-UL59大多數以外泌體形式存在。因此，可以推測HCMV miRNA的變化也可能是由病毒感染或炎癥細胞分泌的EVs引起。但是，各種疾病中HCMV miRNA的存在形式仍需進一步驗證，HCMV感染與EVs miRNA之間的具體機制仍然未知。

綜上所述，血清HCMV miR-US4-3p在DN中高表達，其可能是DM患者腎臟損傷的重要生物學標志物，但血清miR-US4-3p與微量尿蛋白指標的比較以及其在DN發生發展過程中的具體病理生理機制仍需深入研究。鑒于本研究例數有限，仍需要進一步擴大樣本量、開展前瞻性研究及臨床隨訪再次驗證和確定血清HCMV miR-US4-3p對DN患者的臨床價值。