E型沙眼衣原體持續性感染模型的建立與鑒定

(南華大學衡陽醫學院病原生物學研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南省衡陽市 421001)

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是專性細胞內寄生病原體，具有獨特的雙相發育周期。Ct生殖道感染通常呈慢性或無癥狀，容易形成上行性感染，從而導致嚴重并發癥，例如附睪炎、前列腺炎、子宮內膜炎、異位妊娠和不育等[1-2]。盡管許多國家實行了包括教育、篩查和抗生素治療在內的公共衛生干預，Ct感染仍然是一個嚴重的全球性健康問題[3-4]。

Ct原體(elementary body，EB)通過內吞、受體介導等方式進入宿主細胞后發育為網狀體(reticulate body，RB)，當RB暴露于不利的環境條件時，形成異常增大、有一定代謝活力而無感染力的RB，稱為異形體(aberrant body，AB)，從而進入持續性感染。抗生素的暴露、氨基酸、葡萄糖、鐵的剝奪以及病毒感染等均被證明可誘導衣原體持續性感染[5-7]。Ct持續性感染與致病性和藥物敏感性等密切相關，因此，建立Ct持續性感染模型可為研究其致病機制和新藥研發提供重要研究手段。Ct持續性感染的誘導因素中，干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和青霉素最為常見[8-9]。IFN-γ主要通過活化吲哚胺-2，3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)，IDO將色氨酸分解為犬尿氨酸，從而引起Ct發生營養應激；青霉素可使青霉素結合蛋白失活，抑制細菌細胞壁合成所需的肽聚糖交聯作用，促進Ct進入持續性感染狀態。為建立適宜的細胞內生存環境，衣原體已進化多種策略調控宿主細胞生物學行為，其中，抵抗宿主細胞凋亡是衣原體實現免疫逃逸的重要機制之一[10-12]。

Ct共有19個血清型，不同國家和地區Ct感染基因型存在差異。流行病學發現，江蘇省、廣東省、廣西省和海南省的男性Ct陽性標本以血清型F、E、J、D和G型為主[13]；廣東省男性尿液中Ct感染以血清型D、E、F和J型為主[14]；中國南方地區女性生殖道中Ct感染以血清型E、F、J和D型為主[15]。鑒于E型Ct(Ct E)感染在臨床上較為常見，且IFN-γ作為誘導劑更能模擬生理狀態下宿主與衣原體之間的相互作用，因此，本實驗選擇IFN-γ作為持續性感染誘導劑，建立E型Ct持續性感染細胞模型，并分析了Ct感染細胞抵抗細胞凋亡的能力，為進一步探討Ct持續性感染致病機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料

FITC-Annexin V/PI凋亡試劑盒為蘇州宇恒生物科技公司產品；TRIZol為Invitrogen公司產品；Cy2標記的羊抗兔IgG抗體為Proteintech公司產品；DEAE-葡聚糖為Sigma公司產品；Ct E型菌株、HeLa細胞均為南華大學病原生物研究所保存。

1.2 衣原體持續性感染模型的構建

將HeLa細胞接種于6孔板培養過夜，當融合度為80%時，吸棄培養基，細胞經30 mg/L DEAE預處理15 min后，每孔加入Ct E血清型感染2 h，隨后更換為含25～150 U/mL IFN-γ、2 mg/L放線菌酮和10% FBS的DMEM培養基，37℃、5% CO2細胞培養箱中培養40 h。部分實驗在Ct持續性感染誘導24 h時更換為不含IFN-γ的新鮮培養基，繼續培養16 h后收集衣原體，再感染新的HeLa細胞，分析去除IFN-γ后衣原體感染力。實驗中以不加IFN-γ培養基的衣原體感染組作為急性感染組對照。

1.3 間接免疫熒光檢測衣原體包涵體

HeLa細胞經不同因素處理后，依次經4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100透化和含10% FBS的DMEM封閉處理后，加入兔抗Ct抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后再加入Cy2標記的羊抗兔IgG抗體以及核酸染料Hoechst 33258，37 ℃、1 h，熒光顯微鏡計算Ct包涵體形成單位(inclusion forming units，IFUs)，每個樣本隨機挑選高倍鏡視野5～10個，Image J軟件計算包涵體大小(以面積表示大小)。

1.4 實時熒光定量PCR檢測Ct相關基因表達水平

分別收集12、24、40 h急性感染組和持續性感染組細胞，TRIZol裂解液提取不同時間總RNA。從GenBank中查找Ct dnaA、dnaK、groEL、ompA、ftsK、htcA、oppA.4和htrA基因序列，設計各目的基因特異性引物，基因引物序列見表1，引物由上海生工生物公司合成。以總RNA為模版反轉錄成cDNA，然后再進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)擴增，體系設置為cDNA 1 μL，SYBR? Green PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL，滅菌蒸餾水9.5 μL。反應條件設置為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環后，72 ℃繼續延伸5 min。通過2-△△Ct計算目的基因mRNA的相對轉錄水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Hoechst染色分析細胞凋亡率

Ct持續性感染12、24、40 h時加入20 μg/L腫瘤壞死因子-α(TNF-α)處理6 h誘導細胞凋亡，同時設立對照組。細胞經固定、透化和封閉后，加入Hoechst 33258，室溫下避光染色30 min，PBS洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察。每個樣本隨機選取5個視野，計算視野中總細胞數和凋亡小體數量，依照公式對各時間點凋亡率進行計算，細胞凋亡率(%)=細胞凋亡數/總細胞數×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

分別收集Ct急性感染和持續性感染12、24、40 h后并且經TNF-α處理的HeLa細胞，100 μL結合緩沖液重懸細胞(5×105個)，每管加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI工作液，4 ℃避光孵育15 min，流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 IFN-γ誘導Ct持續性感染最佳劑量

與未處理組(0 U/mL)比較，50、75、100和150 U/mL IFN-γ均可降低Ct的感染能力(P<0.05)。當IFN-γ劑量增加為75 U/mL及以上時，子代Ct IFUs較未處理組顯著降低(P<0.001；圖1和圖2)，故選擇75 U/mL IFN-γ作為Ct持續性感染最佳誘導劑量。

圖1 不同劑量IFN-γ對Ct子代IFUs的影響(Hoechst 33258染色)

圖2 不同劑量IFN-γ對Ct持續性感染的影響a為P<0.05，b為P<0.001，與未處理組(0 U/mL)比較。

2.2 持續性感染狀態下Ct包涵體的形態變化

與IFN-γ未處理組比較，IFN-γ誘導后包涵體結構相對疏松，包涵體面積為(89.33±15.56) μm2，顯著小于IFN-γ未處理組(144.70±12.34) μm2(P<0.05)，并且出現大小不均一的現象(圖3)。

圖3 持續性感染下Ct包涵體的形態學變化(Hoechst 33258染色，1 000×)

2.3 移除誘導因素后Ct感染能力的恢復

IFN-γ移除組子代Ct IFUs為(12.60±0.52)×109/L，而未移除IFN-γ組IFUs為(3.60±0.52)×109/L，培養過程中移除IFN-γ后，子代衣原體感染力得到顯著提高(P<0.05；圖4)。

圖4 IFN-γ對子代Ct IFUs的影響(Hoechst 33258染色，400×)

2.4 持續性感染狀態下Ct基因轉錄水平檢測

Ct持續性感染狀態下，dnaA和dnaK轉錄水平24 h明顯受到抑制(P<0.05；圖5)；熱休克蛋白60編碼基因groEL和細菌分裂相關基因ftsK在持續性感染中期階段轉錄水平受到抑制(P<0.05；圖5)，而在感染晚期釋放階段，急性感染細胞中兩者轉錄水平下降，低于持續性感染細胞(P<0.05；圖5)；膜結構基因ompA轉錄水平顯著低于急性感染(P<0.05；圖5)；參與發育調節的htcA轉錄水平在感染晚期階段低于急性感染；參與能量代謝的oppA.4和htrA在兩種感染狀態下差異無顯著性(P>0.05；圖5)。以上結果表明，Ct在持續性感染狀態下仍具有代謝活性，但其DNA復制、細菌分裂和發育周期調節均受到抑制。

圖5 急性感染和持續性感染12、24、40 h Ct相關基因相對轉錄水平的比較a為P<0.05，與同時間持續性感染組比較。

2.5 Ct持續性感染抵抗宿主細胞凋亡

TNF-α誘導細胞凋亡后，Hoechst染色結果顯示(圖6A)，與陽性對照組比較(31.46%)，Ct持續性感染12 h、24 h和40 h的細胞凋亡率分別為14.32%(P<0.05)、16.98%(P<0.05)和24.83%(P>0.05)。FCM結果顯示(圖6B)，Ct持續性感染12 h和24 h的細胞凋亡率分別為14.77%、18.71%，均顯著低于陽性對照組(33.63%；P<0.05)，感染40 h時細胞凋亡率為26.32%，與陽性對照組差異無顯著性(P>0.05)。Ct在感染12和24 h時呈現抗凋亡現象，隨著感染時間延長，Ct抗凋亡能力下降。

圖6 Ct持續性感染12、24、40 h抵抗TNF-α誘導的細胞凋亡A為Hoechst染色檢測細胞凋亡(200×)；B為FCM檢測細胞凋亡。a為P<0.05，與陽性對照組比較。

3 討 論

Ct是世界范圍內引起性傳播感染的主要病原體之一，可在細胞因子、營養缺陷和某些抗生素應用等不利情況下，形成形態異常且體積明顯增大的AB，AB有活力但無感染力，能長期存在于細胞內，是衣原體持續性感染的重要標志。盡管針對Ct已開發出了許多藥物進行治療，但衣原體在宿主體內形成隱匿的持續性狀態仍是衣原體長期且反復感染的根本問題。因此，構建Ct體外持續性感染的細胞模型能夠為探究衣原體持續性感染狀態下的分子機制提供研究基礎。

NK細胞和活化的T淋巴細胞是IFN-γ的主要來源細胞[16]。與青霉素相比，IFN-γ是機體內源性產生的免疫調節因子，以IFN-γ作為誘導劑的Ct持續性感染模型相比于青霉素所誘導的模型，更為接近衣原體感染宿主后的生理狀態。IFN-γ誘導持續性感染的主要機制在于其誘導IDO的生成，該酶是色氨酸分解代謝過程中的關鍵酶，而色氨酸是Ct生長發育過程中必不可少的氨基酸。IFN-γ誘導IDO生成后，色氨酸分解為犬尿氨酸導致衣原體可利用的色氨酸減少，從而抑制衣原體生長。由于生殖道Ct(血清型D-K型)的色氨酸合成酶基因trpBA可將陰道菌群所分泌的吲哚轉化成為色氨酸，使得Ct在IFN-γ誘導的色氨酸缺乏狀態下不會因為色氨酸的完全缺乏而死亡，進入持續性感染狀態。本實驗使用不同劑量IFN-γ處理Ct感染細胞，研究發現75 U/mL IFN-γ可顯著誘導建立E型Ct持續性感染。

Ct在持續性感染過程中，其形態會發生顯著變化。不同誘導因素下，不同種屬衣原體在不同類型的宿主細胞中所形成的包涵體形態具有一定差異。在青霉素G誘導的持續性感染模型中，E型Ct感染HeLa細胞后，包涵體顯著減小，結構致密[6]；而青霉素G誘導鸚鵡熱衣原體Hep-2細胞持續性感染狀態下，包涵體形狀上多不規則，包涵體同質性降低[17]；IFN-γ誘導Hep-2細胞中E型Ct持續性感染中，包涵體輪廓不規則，呈現多形態性，體積上大小不均一[18]。本實驗發現IFN-γ誘導后，Ct包涵體大小和形態發生改變，移除IFN-γ誘導劑，包涵體形態部分得到恢復，子代衣原體感染后IFUs顯著增加。

Ct持續性感染期間，除形態發生變化外，參與膜結構、能量代謝和發育周期調節等細胞生物學進程的基因表達同樣也會發生變化[17]。AB在細胞內表現為具有代謝活力而復制能力減弱，因此本實驗對衣原體參與DNA修復和重組相關的dnaA和dnaK、參與細菌分裂的ftsK、參與蛋白水解和肽轉運的oppA.4和htrA、參與衣原體膜結構的ompA以及發育調節的htcA和groEL進行了轉錄水平的檢測。結果發現與DNA重組(dnaA和dnaK)、細菌分裂(ftsK)、膜結構(ompA)相關基因的轉錄在持續性感染中期階段明顯受到抑制。DNA重組和細菌分裂發生于衣原體感染早期階段，該階段EB分化形成RB后，RB從宿主細胞中獲取營養物質從而實現自身增殖，IFN-γ誘導的持續性感染則限制了Ct攝取營養進行復制。值得注意的是，在感染晚期階段，急性感染細胞中RB再分化為EB，因此參與復制和分裂相關基因的轉錄水平明顯降低。

衣原體通過抵抗宿主細胞凋亡來完成自身增殖，抗凋亡效應是衣原體自我保護機制之一[10,19-21]。因此，對衣原體感染抗凋亡機制的研究，能夠為治療衣原體感染提供新的靶點。為檢測Ct持續性感染狀態的抗凋亡作用，通過Hoechst染色和FCM對細胞凋亡率的分析，證實Ct感染后能抵抗宿主細胞凋亡，并且發現隨著感染時間的延長，Ct抗凋亡能力下降，推測可能與Ct感染晚期EB釋放有關。

總之，本實驗成功構建了IFN-γ誘導的E型Ct持續性感染體外模型，發現Ct在持續性感染狀態下仍具有代謝活性，參與Ct DNA復制、細菌分裂和發育周期調節等相關基因在持續性感染中期或晚期轉錄水平發生明顯改變，本研究為進一步探討Ct致病機制提供實驗依據。