Apelin-13對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織中自噬的影響

(南華大學附屬第一醫院胃腸外科，湖南省衡陽市 421001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于各種因素引起的胰酶被激活而造成胰腺及周圍正常組織呈現自身消化進而引起的急性炎癥性疾病。AP在病情控制不好而進展為伴有局部及全身并發癥的急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing panceratitis,ANP)、重癥急性胰腺炎(severe acute pacreastitis,SAP)時其病情非常兇險，因為其可發展成為全身炎癥反應綜合征、胰腺組織壞死及出現多器官功能障礙綜合征，死亡率可達15%～20%[1]。自噬是細胞生存的機制之一，參與并維持著機體的正常生物活動，LC3-Ⅱ、Beclin-1為參與自噬過程不同階段的重要蛋白質。目前已證實自噬可以調節細胞的代謝來適應外部環境的刺激[2]以及調控多細胞機體的免疫及炎癥反應等[3]。自噬參與了急性胰腺炎的病理和生理過程，并且不正常的自噬促使了胰蛋白酶的激活，進而誘發急性胰腺炎。Apelin是一種具有生物活性的肽類激素，具有多個亞型，其中Apelin-13是正常人體血漿中存在的最主要的亞型[4-5]。而且Apelin可以通過阻礙NF-κB的活化從而抑制炎癥反應[6]。本實驗通過研究Apelin-13對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織病理學變化、自噬相關基因LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達情況以及血清淀粉酶水平的影響，來探究Apelin-13在ANP治療中的作用及其機制，以期為探索ANP新的治療方案提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試劑

牛磺膽酸鈉、抗LC3-Ⅱ抗體購自美國Sigma公司，水合氯醛購自上海生工生物公司，抗β-Actin購自中國中杉金橋生物技術有限公司，Apelin-13購自美國Santa公司，抗Beclin-1抗體購自美國BioVision公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司，ECL顯色液購自美國Pierce公司。

1.2 動物及分組

8周齡健康、清潔級SD大鼠54只，由南華大學動物部提供，雌雄不限，體質量220～250 g，25 ℃室溫條件下自由飲水、攝食。將54只SD大鼠隨機分為對照組、造模組、給藥組，每組18只。各組內再采用隨機分組法分為處理后3 h、6 h、12 h亞組，每個亞組6只SD大鼠。

1.3 ANP模型的建立

造模組和給藥組采用改良的Ahd方法經十二指腸乳頭微量泵逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 mL/min，1 μL/g)構建急性壞死性胰腺炎模型[7]，即實驗前SD大鼠禁食12 h、禁水2 h，于SD大鼠的腹腔內注射10%的水合氯醛(3 μL/g)約5 min后大鼠被完全麻醉，將其于實驗架固定、腹部予以備皮、消毒、鋪無菌單。取其劍突下正中切口依次進入腹腔，用眼科鑷緩慢拉出十二指腸，見一斜型透明的管道開口于十二指腸大乳頭處，確定了此斜型透明的管道即為胰膽管，胰腺組織呈粉紅色、片狀包繞透明的胰膽管，用無損傷的動脈夾將肝門部的膽管予以夾閉，以防濃液進入肝臟，用無菌鉗輕柔地提起十二指腸，在十二指腸大乳頭孔側邊的無腸系膜血管區的腸壁上緩慢地插入一次性靜脈留置針，仔細辨別胰膽管的起始部位和胰膽管的走向，將留置針緩慢地插入胰膽管，長度約5 mm，拔出留置針針芯后將膽總管段的留置針輕輕捏住，等待助手將留置針末端的導管接至裝有5%的牛磺膽酸鈉注射器，然后使用微量輸液泵勻速推注5%的牛磺膽酸鈉溶液,緩慢勻速注完，拔出針頭用生物蛋白膠封閉腸壁穿刺孔，縫合關腹。5 min后給藥組大鼠尾靜脈注射Apelin-13(0.1 μg/g)，造模組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。對照組大鼠開腹僅翻動胰腺后關腹，尾靜脈注射等量的生理鹽水。造模完成后根據血清淀粉酶水平、病理學變化對ANP大鼠模型是否建立成功進行判定。

1.4 胰腺大體和病理形態觀察

按照實驗分組方案，在術后的3 h、6 h、12 h肉眼觀察胰腺病理變化及鈣化灶、胰腺周圍器官的血運情況，然后腹主動脈穿刺取血3～5 mL,采血完成后立即處死大鼠，然后將大鼠的胰腺組織切下，取一部分胰腺組織用10%的中性甲醛固定，常規HE染色，光鏡下閱片，觀察胰腺組織病理學變化，并進行胰腺組織的病理評分。按照改良的Schmidt評分標準[8]對大鼠胰腺組織進行病理評分，評分越高代表胰腺損傷程度越重。

1.5 血清淀粉酶的檢測

將新鮮大鼠血液4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶。

1.6 Western blot測定自噬相關蛋白

將切下的胰腺組織保存在-80 ℃冰箱，提取胰腺組織總蛋白，Western blot檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達情況。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 3組大鼠各時間點血清淀粉酶比較

對照組各時間點血清淀粉酶含量差異無顯著性；造模組、給藥組各時間點較對照組的血清淀粉酶含量均明顯升高(P<0.05)。與造模組比較，給藥組大鼠各時間點血清淀粉酶明顯降低(P<0.05；表1)。

表1 3組大鼠各時間點血清淀粉酶比較 單位：U/L

2.2 3組大鼠胰腺形態變化

對照組中胰腺組織未見水腫，形態呈分葉狀，分葉結構清晰，質軟。造模組胰腺重度充血水腫，呈紫黑色，可見出血、壞死的表現及有胃腸道擴張及胃儲留現象，有皂化斑形成，并有少量或中量腹水形成。給藥組可見組織局部水腫，表面充血，包膜張力增高(圖1)。

圖1 3組大鼠術后不同時間胰腺形態

2.3 3組大鼠胰腺組織病理變化

對照組各時間點的胰腺未見明顯病理變化，結構清晰，腺泡較完整，葉間偶見水腫，無出血、壞死等表現。造模組中可見灶狀或大片狀壞死表現，腺泡結構遭到破壞，并見炎癥細胞及紅細胞浸潤，血管擴張有出血表現，給藥組大鼠各相對應的時間點胰腺組織的水腫、炎癥、出血及壞死表現均較造模組大鼠程度有所減輕，偶爾可見小部分胰腺腺泡細胞變性壞死(圖2)。

圖2 3組大鼠術后不同時間胰腺組織病理變化(HE,100×)

2.4 3組大鼠胰腺組織病理改變評分比較

造模組、給藥組與對照組同一時間點的病理評分比較，差異有顯著性(P<0.05)；造模組損傷評分明顯增加，且隨著時間的延長損傷程度有所增加(P<0.05)；與造模組比較，給藥組大鼠各時間點病理評分明顯降低(P<0.05；表2)。

表2 各組大鼠術后各時間點胰腺組織的病理改變評分 單位：分

2.5 Apelin-13對LC3-Ⅱ蛋白的影響

與對照組比較，造模組及給藥組大鼠胰腺組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達在造模成功后的3 h、6 h和12 h均出現顯著增加(P<0.05)，且在12 h達到高峰；給藥組較造模組在各時間點的LC3-Ⅱ表達顯著降低(P<0.05；圖3和表3)。

圖3 ANP大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量

表3 各組大鼠不同時間LC3-Ⅱ的比較

2.6 Apelin-13對Beclin-1蛋白的影響

與對照組比較，造模組、給藥組大鼠胰腺組織細胞Beclin-1蛋白的相對表達水平顯著增加(P<0.05)，并且在12 h時達到最高。與造模組比較各時間點給藥組大鼠胰腺組織細胞Beclin-1蛋白的相對表達量顯著降低(P<0.05；圖4和表4)。

圖4 ANP大鼠胰腺組織Beclin-1蛋白的相對表達量

表4 各組大鼠不同時間Beclin-1的比較

3 討 論

3.1 SD大鼠ANP模型的建立

國內外學者為了對ANP的發病機制進行研究，對于建立動物模型有著豐富的經驗，與人體疾病類似，其可靠性、可重復性、可控性是建立急性壞死性胰腺炎理想模型[9]的必備條件。ANP的動物模型建立通常有五種方法：雨蛙素注射法[10]、牛黃膽酸鈉胰膽管逆行注射法[11]、結扎法[12]、高鈣血癥法、L-精氨酸誘導法[13]，其中牛黃膽酸鈉胰膽管逆行注射法為首選。此次實驗使用5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射方法制備出了SD大鼠ANP模型，并根據血清淀粉酶水平、病理學變化來對ANP大鼠模型是否建立成功進行了判定。大鼠的造模組、給藥組與對照組的血清淀粉酶值比較有著顯著性提高，并且給藥組較造模組大鼠血清血清淀粉酶有所降低。對照組的胰腺組織未見明顯的病理變化；造模組中可見胰腺組織大片狀壞死、紅細胞及炎癥細胞的浸潤，腺泡結構遭到破壞，并隨時間的延長而有所加重。3 h給藥組可見部分葉間隙出現水腫現象，少許炎癥細胞浸潤，6 h、12 h給藥組可見葉間隙彌漫性水腫，小葉有分離，出現大量炎癥細胞浸潤，并出現少量出血。根據實驗結果，可以證實造模非常成功，并說明了Apelin-13能降低ANP SD大鼠的血清淀粉酶值及緩解胰腺組織的病理損傷程度。

3.2 自噬在ANP發病過程中的作用

自噬在細胞受損時起到了重要的保護作用，正常自噬在急性壞死性胰腺炎發病過程中對胰腺細胞起著很好的保護作用。然而自噬相關蛋白在ANP中表達是增加的，目前此結論已被國內學者在實驗中[13-14]所證實。并有國外的學者在實驗動物和人的胰腺炎腺泡細胞中發現都有空泡的累積[15-16]，并且通過研究證實了大多數空泡就是自噬空泡，且證實自噬溶酶體是自噬空泡的主要組成部分。

現階段學者們已把LC3當作觀察自噬是否存在的標志性分子[17]。LC3有I型和Ⅱ型之分，有研究表明LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值或者LC3-Ⅱ的含量與自噬成正相關[17]，特別是LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量，通常可以用來反映自噬的活性。本次實驗應用Western blot來檢測LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量，結果顯示造模組各時間點LC3-Ⅱ蛋白的表達較對照組明顯增加。由此表明了SD大鼠發生ANP后自噬活性是增強的且自噬活性會隨著病理損傷程度的加重而增加。

Beclin-1基因已知廣泛存在于人類的正常組織中，它最主要的作用是調節自噬過程，因而被稱為“自噬基因”。Beclin-1對自噬的調控起到了重要作用[18]，一旦Beclin-1基因缺失時將會導致自噬活性明顯降低[19]。本次動物實驗結果中造模組各時間點的Beclin-1蛋白的表達較對照組明顯增加。

3.3 Apelin-13對ANP中自噬相關蛋白表達的影響

本實驗采用Western blot來檢測自噬相關蛋白的相對表達量。結果顯示給藥組SD大鼠發生ANP后各時間點的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達量較造模組顯著降低，提示ANP后自噬活性可能被Apelin-13所抑制。證實了Apelin-13通過對自噬活性的抑制來實現對大鼠ANP后胰腺組織細胞的保護。

綜上所述，Apelin-13可以通過下調自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達水平及抑制SD大鼠ANP后的自噬活性，來實現對胰腺組織的保護作用。從而為ANP的藥物治療開拓了新的臨床思路。