異常增加的α?突觸核蛋白對帕金森病模型小鼠黑質及結腸多巴胺受體D1的表達影響

徐曉峰 羅漢將 莫瓊 左麗絲 黃秀仙 陳敏

桂林醫學院附屬醫院神經科學實驗室，廣西神經系統疾病臨床研究中心，廣西腦與認知神經科學重點實驗室（廣西桂林541001）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是常見的好發于中老年人的神經退行性疾病［1］，PD 患者的黑質紋狀體系統及腸神經系統均出現α?突觸核蛋白（α?synuclein，α?Syn）異常表達、聚集和多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性［2-3］。現有PD 動物模型研究證明，黑質致密部酪氨酸羥化酶（tyro?sine hydroxylase，TH）陽性神經元減少及紋狀體DA含量降低，多巴胺受體D1（dopamine receptor D1，D1DR）表達下降［4-5］。而結腸等消化器官中D1DR的表達是否發生變化尚不清楚。異常增加的α?Syn 是否影響腦及結腸中D1DR 的表達亦未探明。然而，DA 及DR 在胃腸道的表達對胃腸運動、胃酸分泌、胃黏膜血氧供應等胃腸功能的調節起重要作用［6］。因此明確PD 發生時胃腸道D1DR 的改變對PD 非運動癥狀發生機制的探索有重要臨床意義。本研究擬通過C57BL/6J 小鼠紋狀體內注射α?Syn 預成型纖維（pre?formed fibrils，PFF）建立PD 動物模型，探索異常增加的α?Syn 所致黑質和結腸中D1DR 變化的潛在聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物野生C57BL/6J雄性小鼠16只，8周齡，體質量約25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養于桂林醫學院附屬醫院動物研究中心，恒溫恒濕，自由飲食、飲水。實驗及實驗中外科手術均符合實驗動物護理和使用研究指南，并已獲得桂林醫學院實驗動物倫理委員會批準（No.2019?0010）。

1.2 主要試劑及儀器α?Syn PFF（StressMarq，加拿大），D1DR 抗體（DF7097，Affinity，美國），α?Syn抗體（610787，BD，美國），TH 抗體（AB152，Milli?pore，美國），β?actin 抗體（C1313，北京普利萊，中國），Alexa?fluor 488 標記山羊抗兔IgG、兔SPN 試劑盒（ZF0511、SPN?9001，北京中杉金橋，中國），腦立體定位儀（深圳瑞沃德，中國），小鼠曠場實驗分析系統（上海欣軟，中國），熒光顯微鏡（Nikon，日本），ODYSSEY 雙色紅外熒光成像系統（LI?COR，美國）。

1.3 動物模型制備通過行為學訓練，選取運動能力接近的16 只C57BL/6J 小鼠，隨機分為對照組（n= 8）和模型組（n= 8）。用4%的水合氯醛麻醉后，通過立體定位注射將2 μL 1 mg/mL 的α?Syn PFF 緩慢注射至模型組右側紋狀體內（前囟前0.2 mm，旁開2.0 mm，縱深3.0 mm），對照組注射等體積0.01M PBS（pH 7.4）。術后飼養6 個月，行為學檢測小鼠運動能力差異，取腦及結腸組織進行檢測。

1.4 行為學訓練及檢測造模前，小鼠進行3 次平衡桿、爬桿訓練。造模6 個月后進行平衡桿、爬桿實驗及曠場實驗。平衡桿實驗：100 cm × 1 cm× 1 cm 平衡桿水平置于離地50 cm 處，將距兩端10 cm 處分別定為起、終點。記錄小鼠從起點到達終點的時間。爬桿實驗：100 cm × 1 cm × 1 cm 長桿垂直于地面，記錄小鼠從桿頂端起點至終點所用時間。曠場實驗：記錄小鼠在50 cm × 50 cm ×40 cm 曠場箱內自由運動10 min 的運動軌跡及平均運動速度。

1.5 Western blot（WB）實驗方法［7］簡述如下：取小鼠黑質及距肛門4 ～6 cm 處結腸，RIPA 裂解液冰浴裂解，12 000 轉離心獲取上清，BCA 法測定蛋白濃度，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后孵育兔源TH 抗體（1∶10 000）、鼠源α?Syn 抗體（1∶1 000）、兔源D1DR 抗體（1∶2 000）、內參β?actin（1∶10 000）4 ℃過夜，對應源性熒光二抗（1∶10 000）室溫1 h，ODYSSEY 雙色紅外熒光成像系統掃膜。利用Im?ageJ 軟件分析目的蛋白與內參的光密度值比值，對目的蛋白的表達量進行半定量分析。

1.6 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）及免疫熒光（immunofluorescence，IF）IHC：小鼠麻醉后，37 ℃預熱生理鹽水灌流心臟，沖凈血液后更換為預冷的4%多聚甲醛灌注固定。剝離鼠腦及結腸組織，后固定48 h 及蔗糖梯度脫水后進行冰凍切片，厚度20 μm。將組織切片置于0.3%過氧化氫30 min，用含0.3% Triton?X 100 的PBS 通透過夜，2%山羊血清封閉后，4 ℃孵育兔源D1DR抗體（1∶500）、兔源TH 抗體（1∶10 000）48 h，兔SPN 試劑盒識別一抗后用二氨基聯苯胺（DAB）溶液顯色，脫水封片后于顯微鏡下觀察，以細胞質著棕黃色為陽性細胞，隨機選擇5 個視野拍照，記錄陽性細胞數。IF：一抗孵育后，使用山羊抗兔Alexa?fluor 488（1∶2 000）室溫孵育1 h。用含DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察。

1.7 統計學方法使用Image J 軟件進行圖像分析，利用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數據統計及分析，數據以均值±標準差表示，t檢驗分析評估組間統計學差異，連續變量相關性分析用Pearson相關分析。P＜0.05 時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠PD 模型建立行為學結果顯示，與對照組相比，6 個月后模型組小鼠通過平衡桿及爬桿所需時間延長（P＜0.001，表1），曠場平均運動速度減慢（P＜0.001，表1），運動軌跡集中在曠場四周且明顯稀疏（圖1），表現其出現運動遲緩、探索行為減少等PD 典型癥狀。同時，IHC 結果顯示模型組小鼠黑質TH陽性神經元明顯減少（P＜0.01，圖2），提示紋狀體立體定位注射α?Syn PFF 構建小鼠PD模型成功。

表1 小鼠行為學實驗結果Tab.1 Behavioral experimental results of mice x±s

圖1 小鼠曠場實驗運動軌跡Fig.1 Motion trail in open field test

2.2 異常增加的α?Syn下調小鼠黑質D1DR表達WB 結果顯示，模型組小鼠黑質中α?Syn 表達增加（P＜0.001，圖3A、C），D1DR 及TH 表達明顯低于對照組（P＜0.01，圖3A、B；P＜0.05，圖3A、D），同時IF 結果也表現為模型組D1DR 陽性神經元減少，熒光強度減弱（P＜0.01，圖4），表明異常增加的α?Syn 可以下調黑質D1DR 的表達。

2.3 結腸組織D1DR、TH 表達降低且與黑質對應表達改變呈正相關WB 顯示，模型組結腸中D1DR 及TH 的表達低于對照組（P＜0.01，圖5），且其相對表達量與黑質中的相對表達量呈正相關（r=0.894 3、0.902 6，P＜0.05，圖7A、B）。此外，IHC 結果亦出現模型組D1DR 陽性細胞數減少（P＜0.05，圖6），與WB 結果一致。

3 討論

本研究通過紋狀體立體定位注射α?Syn PFF制備α?Syn 異常增加的小鼠PD 模型，通過WB、IHC及IF 等檢測手段發現PD 小鼠黑質及結腸中D1DR及TH 表達出現平行下降，為結腸活檢應用于評估早期PD 患者中樞神經病理提供了實驗基礎。

圖2 小鼠黑質TH（IHC）Fig.2 IHC results of TH in substantia nigra of mice

圖3 小鼠黑質D1DR、α?Syn、TH 蛋白的表達Fig.3 Expression of D1DR，α?Syn and TH in substantia nigra of mice

圖4 小鼠黑質D1DR（IF）Fig.4 IF results of D1DR in substantia nigra of mice

圖5 小鼠結腸D1DR、TH 蛋白表達Fig.5 Expression of D1DR，TH in the colon of mice

圖6 小鼠結腸D1DR（IHC）Fig.6 IHC results of D1DR in the colon of mice

PD 的典型臨床表現除常見的運動癥狀外，還伴有便秘、吞咽困難，睡眠異常，抑郁等非運動癥狀［8-9］。在出現運動癥狀之前，許多PD 患者常出現營養不良、便秘等消化道癥狀［10-11］。越來越多的證據表明，PD 的臨床診斷大多發生在疾病進展的較晚階段［12］，而其病理改變可能更早地起源于胃腸道，進而進展到大腦［13-14］。BRAAK 假說［15］認為，在PD 患者中，消化系統黏膜下神經叢的α?Syn錯誤折疊和聚集可通過一系列連續的投射神經元到達大腦。KIM 等［16］驗證了α?Syn 造成的病理改變可通過迷走神經以固定的方式從胃腸道傳播到腹側中腦，選擇性地破壞黑質致密部DA 能神經元。在PD 中，基底神經節回路中黑質?紋狀體通路的退化［17］和多巴胺能信號的失衡導致患者出現運動障礙［18-19］。通過在大鼠中腦腹側部過表達人源α?Syn，ULUSOY 等［20］在節前迷走神經軸突末梢及胃壁內臟運動神經末梢均探測到外源性α?Syn的存在，提示了PD 患者α?Syn 在腸神經系統的沉積也可能經迷走神經來自中樞神經系統。因此，本研究推測，α?Syn 的異常增加與DA 能神經元退化在中腦黑質和結腸中存有潛在聯系。生理條件下，α?Syn 維護突觸完整性和穩定性、參與調節DA的生物合成，對正常神經活動具有重要作用［21］。而在病理情況下，α?Syn 可寡聚化為可溶性原纖維導致路易小體的形成［22］。已有研究證實，野生型非轉基因小鼠單側紋狀體內接種合成的α?Syn 原纖維可導致類似PD 的路易小體出現［23］。

圖7 小鼠黑質及結腸D1DR、TH 的相關性分析Fig.7 The relevance analysis of D1DR，TH in substantia nigra with colon of mice

本研究通過紋狀體立體定位注射α?Syn PFF制備小鼠PD 模型，通過行為學檢測發現模型組小鼠平衡桿及爬桿所需的時間明顯延長，平均運動速度減慢，提示注射α?Syn PFF 的小鼠出現了明顯的運動障礙。WB 及IHC 檢測結果顯示黑質TH 表達下降及陽性神經元明顯減少，WB 及IF 結果顯示D1DR 表達下降及D1DR 陽性神經元減少。上述結果表明，異常增加的α?Syn 可以導致DA 能神經元變性并抑制D1DR 的表達。同時，本研究發現模型組小鼠結腸中D1DR 及TH 均低于對照組小鼠，與其在黑質中的表達改變呈正相關。提示α?Syn 的異常增加可能通過影響結腸的D1DR 及TH 的表達導致胃腸功能紊亂。

本研究采用小鼠紋狀體內注射α?Syn PFF 構建PD 模型能較好地模擬PD 患者的病理情況，對結腸組織相關分子表達的研究將有助于探討PD患者胃腸道癥狀發生的機制。但鑒于樣本量限制，未來將擴大動物模型樣本量來進行實驗分析，重點關注α?Syn是如何抑制D1DR表達的分子機制，進一步探討PD中運動癥狀與胃腸道癥狀的相互關系。

綜上所述，本研究發現在紋狀體立體定位注射α?Syn PFF 制備的小鼠PD 模型中，黑質及結腸D1DR、TH 均表達降低且存在平行的改變，該發現對研究PD 患者胃腸道癥狀的發生機制有一定的提示作用，為結腸活檢應用于評估早期PD 患者中樞神經病理提供了實驗基礎。