缺氧條件下CK1δ和PER1可調控BV2細胞的線粒體形態

金晶 劉雨朦 張棟 葛建 陳思源 施海媛 何明利

1徐州醫科大學附屬連云港醫院神經內科（江蘇連云港222002）；2南京醫科大學連云港臨床醫學院（江蘇連云港222002）

缺血性腦卒中是一種常見的難治性疾病，其主要發病機制是腦血管阻塞導致局部腦組織缺血缺氧，進而導致一系列病理生理事件，例如小膠質細胞的激活、能量代謝異常、氧化應激等［1-3］。近幾年的研究顯示缺血性腦卒中的發病時間及損傷程度具有時間依賴性［4-5］，疾病與晝夜節律之間的潛在聯系受到關注。OLIVEIRA 等［6］研究顯示生物體晝夜節律的異常會改變缺血性腦卒中患者的活動水平。同時，動物實驗觀察到缺血性腦損傷與核心生物鐘蛋白PER1 的節律性改變密切相關［7］。上述實驗均提示晝夜節律的破壞可能參與了缺血性腦卒中的發生發展過程。

PER1 蛋白是晝夜節律調控中的重要一環，CK1 蛋白對PER 蛋白的磷酸化被認為是決定生物鐘速度的關鍵步驟［8］。CK1 存在六個亞型（α、γ1、γ2、γ3、δ和ε），CK1δ是大腦和行為節律中介導PER 晝夜起搏的主要內源性調節因子［9］。據報道，CK1 活性改變會影響小鼠的腦梗死體積［10］。此外，WIEBKING 等［11］通過敲除小鼠Per1 基因發現，PER1 能通過調控凋亡和自噬相關因子的表達調節小鼠的腦損傷情況。但最近的研究表明，PER1 能夠優化線粒體功能以適應能量供應/需求的每日變化［12］，提示CK1δ、PER1 對于缺血性腦卒中的調控可能是通過調控線粒體的功能實現的。因此，本研究以BV2 細胞為研究對象，用CoCl2處理細胞來模擬腦卒中時細胞的缺氧狀態［13］，在細胞缺氧條件下，抑制、敲低和過表達CK1δ來檢測晝夜節律的調控基因PER1 及線粒體的功能，以揭示晝夜節律基因CK1δ、PER1 調控缺血性腦卒中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與缺氧處理BV2 細胞購自上海中科院細胞庫，與含10%胎牛血清的DMEM（Gibco）一起置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。將CoCl2（Sigma?Aldrich）溶解于雙蒸水中，配成100 mmol/L母液，分裝保存于-20 ℃冰箱，使用時用完全培養基稀釋成50、100、200、400、800 μmol/L 處理細胞。

1.2 實時定量PCR（quantitative real?time，PCR）使用Trizol（Invitrogen）提取細胞總RNA，并溶解于RNA free 的ddH2O 中，紫外分光光度儀（Invitrogen）分析RNA 純度并測定其濃度。按照逆轉錄試劑盒（Invitrogen）的說明，將RNA 反轉錄為cDNA。Primer Premier 5.0 軟件設計并合成Per1 和CK1δ的引物序列：Per1 正向（5′?3′）GTCTAGCTGGTGCCA?TTCTC 和反向（5′?3′）CTCGATGTAACGGCTTGTG；CK1δ正向（5′?3′）ACGCCGGGATCGAG?AAGAA 和反向（5′?3′）CCGACCGGGAATCTGTG?AG。用PCR儀進行擴增，擴增參數為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增32 個循環，分析數據。

1.3 CK1δ抑制劑PF670462（Med Chem Express）在DMSO（Sigma）中配制成10 mmol/L 儲存液，使用時用培養基稀釋至0.25、0.5、1、2 μmol/L 處理細胞，并用PBS 作為對照。

1.4 CK1δ過表達采用脂質體轉染的方法，按照Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen）的轉染說明，用無血清培養基稀釋pEGFP?CK1δ質粒（上海生工構建）和脂質體，室溫混合20 min 后加入到BV2 細胞中，輕輕混勻，置于37 ℃培養箱中培養，6 h 后更換為完全培養基，用熒光顯微鏡觀察熒光后繼續培養48 h，免疫印跡法（Western blot）檢測CK1δ蛋白的表達。

1.5 siRNA 介導的CK1δ沉默針對CK1δ mRNA不同基因位點設計并合成3 條干擾序列及陰性對照序列（上海吉瑪制藥技術有限公司），分別命名siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3 及siRNA NC。siRNA1正義鏈：GGAUCAGUGAGAAGAAAGAUTT，反義鏈：AUCUUCUUCUCACUGAUCCTT；siRNA2 正 義 鏈：GGGACUACAAUGUCAUGGUTT，反義鏈：ACCAU?GACAUUGUAGUCCCTT；siRNA3 正義鏈：GACAG?CUCUUCAGAAAUCUTT，反義鏈：AGAUUUCUGA?AGAGCUGUCTT。根據lipo2000 說明書，用50 pmol siRNA 轉染6 孔腔中的2.5×105BV2 細胞，6 h 后熒光顯微鏡觀察熒光，48 h 后Western blot 檢測CK1δ蛋白的敲低效果。

1.6 Western blot收集各組細胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，細胞核抽提試劑盒（碧云天）提取細胞核蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。將提取蛋白與蛋白上樣緩沖液1∶4 混合后100 ℃煮沸5 min。使用SDS?PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗Per1（1∶500）、CK1δ（1∶5 000）和Tubulin（1∶1 000）4 ℃過夜，TBST液洗膜3次，隨后加入二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。用顯影儀掃描膠片，Image J 軟件（Bio?Rad 公司，美國）分析條帶灰度值。

1.7 線粒體和細胞核染色將BV2 細胞以5×107接種至激光共聚焦專用培養皿中按照試劑盒說明方法進行線粒體和細胞核標記。細胞培養24 h后，加入Mito Tracker Red（Invitrogen）和Hoechst（凱基生物）染色液，置于培養箱中孵育30 min，共聚焦顯微鏡（Nikon）觀察線粒體和細胞核的形態。

1.8 統計學方法使用SPSS 26.0 軟件分析數據，t檢驗比較兩組之間的差異，單因素方差分析比較多組間的差異。數據表示為均值±標準差，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧條件下Ck1δ和Per1 基因的mRNA 表達水平本研究采用CoCl2處理BV2 細胞后，Western blot 檢測結果顯示，CoCl2濃度為200 μmol/L 時，缺氧誘導因子HIF?1α蛋白的相對表達量達到峰值（圖1A）。用200 μmol/L CoCl2分別處理BV2細胞6、12、24、48 h 來探究最佳處理時間，結果顯示200 μmol/L CoCl2處理細胞在24 h時，HIF?1α蛋白的相對表達量達到峰值（圖1B）。因此，在200 μmol/L CoCl2處理24 h 后提取細胞總RNA，qPCR 檢測結果顯示與常氧條件相比，CK1δ和Per1 在缺氧條件下的mRNA 表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1C、D）。

圖1 Western blot 檢測HIF?1α蛋白和qPCR 檢測CK1δ、Per1 基因的mRNA 表達量Fig.1 Western blot detects HIF?1α protein，qPCR detects the mRNA expression levels of CK1δ and Per1 genes

2.2 抑制、敲低和過表達CK1δ后細胞總PER1 蛋白表達CK1δ特異性抑制劑PF?670462處理BV2細胞后，CK1δ蛋白的表達水平明顯降低，且1 μmol/L PF?670462 處理24 h 對CK1δ蛋白的抑制效果最佳（圖2A）。siRNA 序列干擾以及過表達載體轉染后，與對照組相比，siRNA1 干擾效果最好，CK1δ?pEGFP 的表達量明顯增加（圖2B、C）。1 μmol/L PF?670462、siRNA1、pEGFP?CK1δ在常氧和缺氧條件處理BV2 細胞后，Western blot 結果顯示常氧和缺氧組中CK1δ蛋白的減少或增加不會引起細胞中總PER1 蛋白表達量的改變，但相比于常氧組，缺氧處理后PER1 蛋白表達量有所降低（圖2D），進一步驗證了上述結果。

圖2 抑制、敲低和過表達CK1δ后細胞總PER1 蛋白表達Fig.2 Inhibition，knockdown andoverexpression of CK1 δ induced the expression of total Per1 protein

2.3 抑制、敲低和過表達CK1δ后細胞核中PER1蛋白表達量本研究檢測缺氧條件下CK1δ蛋白表達量改變對PER1 蛋白亞細胞定位的作用，結果發現，常氧和缺氧條件下，抑制和干擾CK1δ導致細胞核中PER1 蛋白表達量上升，過表達CK1δ會降低細胞核中PER1 蛋白的含量。與常氧條件相比，缺氧條件下抑制和干擾CK1δ時，細胞核中PER1蛋白的表達量明顯升高（圖3）。

圖3 抑制、敲低和過表達CK1δ后細胞核中PER1 蛋白表達量Fig.3 The expression level of Per1 protein in the nucleus after inhibition，knockdown and overexpression of CK1δ

2.4 qPCR 檢測Tom22、Tim23、Mfn1、Drp1、Ucp1、Pink1 的mRNA 表達量在抑制、敲低和過表達CK1δ后檢測多個線粒體蛋白的變化，qPCR結果顯示，CK1δ表達量的改變對線粒體外膜蛋白Tom22、線粒體內膜蛋白Tim23、解偶聯蛋白Ucp1的mRNA 表達量幾乎沒有影響，差異無統計學意義（P＞0.05，圖4 A、B、D），但抑制和敲低CK1δ會引起線粒體融合蛋白Mfn1 的表達量增加以及線粒體裂變蛋白Drp1 的表達量降低，且過表達CK1δ造成Mfn1 表達量降低以及轉運激酶Pink1、Drp1表達量增加，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4C、E、F）。

2.5 線粒體形態圖4 的結果提示，CK1δ和PER1表達量的改變會影響Mfn1 和Drp1 基因的mRNA表達水平。由于DRP1 和MFN2 是控制線粒體形態的關鍵基因，本實驗利用Mito Tracker 和Hoechst 處理細胞，共聚焦顯微鏡觀察線粒體的形態。結果顯示，相比于對照組，CK1δ抑制劑組和敲低組線粒體的線狀占比增加，而CK1δ過表達組的點狀占比明顯增加。見圖5。

3 討論

CoCl2是目前廣泛用于細胞化學缺氧模擬的藥物之一，能夠穩定持續地誘導細胞處于缺氧狀態［14］。本研究采用CoCl2成功構建了BV2 細胞缺氧模型，缺氧處理后Ck1δ和Per1 的mRNA 表達水平明顯下降，這與之前的研究結果一致，缺氧環境下HIF?1α的激活會改變晝夜節律基因的表達水平［15-16］。已有證據表明，通過物理作用，生物鐘通路和缺氧誘導通路之間存在雙向串擾［16］，但具體的作用機制尚不清楚，是目前研究的活躍領域。

圖4 qPCR 檢測Tom22、Tim23、Mfn1、Drp1、Ucp1、Pink1 的mRNA 表達量Fig.4 qPCR detects the mRNA expression of Tom22，Tim23，Mfn1，Drp1，Ucp1，Pink1

已知CK1 對PER 蛋白的磷酸化作用與亞細胞定位和蛋白降解有關，但是缺氧條件下兩者相互作用的確切機制尚未明確。本實驗抑制或過表達CK1δ后，細胞總PER1 蛋白的表達量不變，但缺氧后兩者蛋白表達量略有下降，進一步驗證缺氧破壞了生物鐘基因的正常表達水平。雖然CK1δ的改變不會影響PER1 總表達量，但卻能影響PER1蛋白的核輸入。抑制CK1δ會促進PER1蛋白入核，尤其是缺氧條件下，當CK1δ被抑制時細胞核中PER1 蛋白的積累量明顯增加。據報道，當CK1 與PER1 兩種蛋白在細胞中共表達時會導致PER1 磷酸化，核定位信號被掩蓋，進而在胞質中積累［17］。因此，抑制或干擾CK1δ的表達可能導致被磷酸化的PER1 蛋白減少，留下未被磷酸化的PER1 蛋白進入細胞核，而過表達的CK1δ可能通過干擾核輸入途徑來改變PER1 的輸入動力學，造成PER1 蛋白在細胞質中積累。此外，本實驗還觀察到缺氧環境下PER1 蛋白的核積累量相比于常氧環境明顯增加，猜想這可能是由于缺氧誘導因子HIF?1α下調了CK1δ的表達，減少了PER1 的磷酸化，或是HIF?1α蛋白的激活可能對PER1 蛋白的核定位信號有增強作用，導致其入核量增加。

圖5 共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態Fig.5 The morphology of mitochondria was observed by confocal microscope

近幾年研究發現，在氧化應激條件下，Per1 基因的表達與線粒體功能之間存在密切聯系［18］。線粒體是一個高度動態的細胞器，會不斷發生融合和裂變［19-20］，與BV2 細胞的活化存在密切聯系［21］。晝夜節律調節器可以通過調節相關基因的表達水平控制線粒體的代謝過程［22］。本實驗結果顯示，CK1δ表達量的改變會影響Mfn1 和Drp1 基因的表達，引起線粒體形態的變化。線粒體形態先前已被證明幾乎可以調節線粒體功能的各個方面：線粒體融合形成廣泛的管狀網絡會導致氧化呼吸和其他功能的整體上調，而線粒體分裂成小片段則相反［23］。此外，SUN 等［12］研究發現Per1 基因缺失會導致線粒體形態發生顯著的異常變化。本研究結果顯示，CK1δ抑制或敲低組Mfn1 表達增加，線粒體的線狀占比偏多，而過表達組Drp1 表達上升，線粒體的碎片化點狀占比較大。這可能是由于抑制或干擾CK1δ促進PER1 蛋白入核，增加了Mfn1 基因的轉錄和翻譯且抑制了Drp1 的表達，從而引起線粒體的融合或裂變，導致其形態改變。然而，這只是分析本研究結果得出的推斷，具體機制將在后續實驗中進一步闡明。

本研究發現晝夜節律基因控制線粒體形態與氧化代謝之間存在分子聯系。晝夜節律基因的調節［24］和線粒體充足的能量供應［25］對于神經元興奮性和存活至關重要，與神經退行性疾病和腦缺血等腦血管疾病的發病機制密切相關。目前對于這些腦血管疾病的治療選擇有限，基于對缺血性損傷潛在的致病分子機制的了解，開發出有效的干預方法來減輕腦損傷至關重要，而缺氧條件下CK1δ和Per1 對線粒體的調節作用可能為缺血性腦卒中新的治療途徑開啟一個新的方向。