過表達精神分裂斷裂基因1對APP/PS1轉基因阿爾茨海默病小鼠突觸可塑性及學習記憶能力的改善

王兆濤 徐如祥 馬全紅 王業忠 姬云翔

1廣州醫科大學附屬第二醫院神經外科（廣州510260）；2四川省人民醫院神經外科（成都610072）；3蘇州大學神經科學研究所（江蘇蘇州215123）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是中樞神經系統最常見的退行性病變［1］。腦內Aβ斑塊的形成是AD 最主要的病理特征之一，其最終將導致神經元突觸喪失，影響AD 患者的學習和記憶能力［2-4］。因此，針對減少Aβ和神經元突觸的喪失是一種治療AD 的有效方式［5］。研究表明：AD 是一種基因異質性疾病，涉及多種分子的調控和信號通路的改變［4，6-9］。精神分裂斷裂基因1（DISC1）最早被發現于家族性精神分裂病中，現已被證明是多種神經和精神疾病的遺傳危險因子。近年來，越來越多的臨床數據證明，DISC1 與AD 的發病存在相關性［10］。但關于DISC1 在AD 發病中的機制的報道仍十分罕見。APP/PS1小鼠是最常用的研究AD的模型小鼠之一，隨著年齡增長，此小鼠腦內逐漸產生Aβ斑塊。因此，本研究將利用小鼠原代神經元和APP/PS1 的AD 小鼠模型，通過過表達DISC1，探索DISC1 對AD 突觸喪失和Aβ斑塊生成的作用，同時探索其對小鼠學習記憶能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物APP/PS1轉基因小鼠及其同窩對照C57BL/6J小鼠購自南京大學模式生物研究所。

1.1.2 腦組織樣本AD 患者和年齡匹配的非AD患者的腦樣本受贈于美國凱斯西儲大學。所有患者均由神經科醫生診斷，驗尸死亡后3 ～21 h 收集大腦樣本。

1.1.3 主要試劑高糖DMEM 培養基、10%胎牛血清、B27、bFGF、EGF、胰蛋白酶、青鏈雙抗、鼠抗Aβ抗體、兔抗人DISC1 抗體、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國賽默飛公司），Aβ肽（美國Abcam 公司）。DISC1 慢病毒及腺相關病毒由上海和元生物技術有限公司構建。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組體外培養野生型C57 胎鼠神經元，分為GFP 組（轉染GFP 對照病毒）、GFP+Aβ組（轉染GFP 對照病毒后進行Aβ處理）、DISC1 + Aβ組（轉染DISC1 過表達病毒后進行Aβ處理），每組重復5 次，檢測神經元樹突棘情況；取2月齡的C57 小鼠，立體定向海馬分別注射GFP 對照病毒和DISC1 過表達病毒，隨后切腦片，Aβ處理后分成3 組，即對照組（立體定向海馬注射GFP 對照病毒）、Aβ處理組（立體定向海馬注射GFP 對照病毒后用Aβ處理）、DISC1+Aβ處理組，每組5 只，使用膜片鉗技術檢測各組的長時程增強（LTP）；C57 小鼠分為WT+GFP 組（野生型小鼠海馬注射GFP 對照病毒）、TG+GFP 組（APP/PS1 小鼠海馬注射GFP對照病毒）、TG+DISC1 組（APP/PS1 小鼠海馬注射DISC1 過表達病毒）三組，每組5 只，免疫熒光染色檢測小鼠腦中Aβ斑塊沉積，Morris 水迷宮檢測各組小鼠學習能力。

1.2.2 Western blot用1×RIPA裂解液（加入1×蛋白酶抑制劑，康為世紀，中國）裂解腦組織。測定蛋白濃度，根據蛋白濃度上樣，每孔上樣30 μg。通過10%SDS?PAGE 凝膠電泳分離蛋白質樣品，并通過轉移緩沖液將蛋白轉移到PVDF 膜上。 然后在室溫下用含有5%BSA 的1×TBST 封閉膜1 h，然后在用5%BSA（1×TBST）稀釋的一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜。之后，將膜與過氧化物酶偶聯的二抗（1×TBST 溶液中1∶10 000 稀釋）孵育1 h。隨后1×TBST 洗膜，3 次5 min。最后使用ECL 化學發光法（Merck millipore，德國）檢測，使用Image?pro plus計算條帶的灰度。

1.2.3 胎鼠原代神經元分離培養分離胚胎14 ～16 d 的小鼠海馬和皮層，用含0.01% DnaseI 的0.25%的胰酶在37 ℃消化10 min。組織塊轉到含10%胎牛血清的DMEM 中，吹打、離心、重懸后，將細胞種在多聚賴氨酸包被的孔板中。細胞培養液為含有B27 的Neurobasal Medium。細胞接種24 h后，用3 × 10-7M 的阿糖胞苷處理細胞抑制膠質細胞生長。

1.2.4 Aβ寡聚體的制備和Aβ處理Aβ42 是所有Aβ中毒性最大的，寡聚化的Aβ42 具有更高的毒性，用Aβ42 寡聚體處理體外細胞可以很好的模擬Aβ 在體內的毒性效應。Aβ 寡聚體的制備：在室溫下將1.0 mg 人工合成的Aβ42 在六氟異丙醇（HFIP）中溶解至1 mmol/L，孵育60 min。在Speed Vac（Sc110 Savant Instruments）中真空除去HFIP，并將凍干的肽膜在-20 ℃下干燥儲存。然后用DMSO將干燥的肽膜溶解至5 mmol/L 作為貯存液。最后，將儲備溶液用PBS 進一步稀釋至1 μmol/L 作為最終濃度，將其在37 ℃下培養5 d 以獲得成熟的寡聚體。Aβ處理：將制備好的寡聚體加入培養基中，使寡聚體的濃度為10 μmol/L，繼續培養一定時間。

1.2.5 樹突棘密度分析小鼠元代神經元培養14 d 后，用GFP 對照慢病毒或DISC1 過表達慢病毒感染神經元。將病毒感染的神經元培養1 周，并用1 μmol/L Aβ42 寡聚物或DMSO 處理12 h。然后用4%多聚甲醛固定細胞，并通過激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。然后將圖像輸入到Image Pro?Plus 軟件中，計算每單位長度樹突棘的數量。

1.2.6 小鼠海馬立體定向注射小鼠異氟烷麻醉后固定在立體定位架上，將小鼠頭皮膚切開，用小鼠顱骨磨鉆在顱骨上鉆一小孔，用10 μL 規格的針以0.2 μL/ min 的速率將2 μL 病毒懸浮液注射到小鼠雙側海馬中（定位點：前囟點后2.1 mmol/L，前囟點兩側±1.8 mmol/L，向下1.8 mmol/L）。 注射后，將針再放置5 min，然后緩慢取出。

1.2.7 膜片鉗檢測小鼠海馬LTP使用振動切片機（Leica VT1200S）從切除的小鼠腦制備橫向海馬切片（400 μm）。在室溫下將切片保持在用95%O2和5%CO2鼓泡的人工腦脊液中至少1 h，然后移至浸入式記錄室，該浸沒式記錄室以1e2mL/min 的速率連續灌注氧合腦脊液。通過填充有3 mol/L NaCl 的玻璃微電極（Frederick Haer Co）在海馬DG區的分子層中記錄興奮性突觸后電位（fEPSP）。將刺激和記錄電極置于齒狀回的分子層中。調整選擇用于基線測量的刺激脈沖（0.2 ms 持續時間，0.033 Hz）以產生其最大斜率的40%。在基線反應穩定30 min 后，使用高頻刺激誘導長時程增強（LTP，5 個100 Hz 和1 s 列車間隔20 s）。用Axon multiclamp 700B 放大器獲得電生理學數據，以0.1e5KHz 過濾，并以10 KHz 數字化，并使用pClamp10.3軟件（Molecular Devices Corp，USA）離線測量和分析fEPSP 的斜率。對照培養基含有：120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L MgSO4、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L d?葡萄糖，所有溶液均含有100 μm 印防己毒素（Sigma，St.Louis，MO）。

1.2.8 Morris 水迷宮實驗小鼠每天給予4 個測試。每次測試由不同的位置開始。每個測試的時間為90 s。連續5 d 記錄小鼠的逃離潛伏期（從起始點到目的平臺游泳所需的時間）、路徑（從起始點到目的平臺的游泳軌跡）。第6 天撤掉平臺，記錄小鼠穿過原平臺所在位置的次數，評價檢測小鼠的空間學習記憶能力。

1.2.9 免疫熒光染色檢測Aβ斑塊沉積提取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規脫水包埋制備切片，切片經清洗、血清封閉。一抗（Aβ抗體，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗，室溫孵育1 h。DAPI 復染細胞核。熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image?Pro Plus 圖像分析軟件分別測定每張切片Aβ斑塊的面積。

1.3 統計學方法實驗數據應用SPSS 20.0 軟件進行統計。計量資料以均數±標準差表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 方法，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DISC1 在AD 患者腦皮層中表達與年齡相匹配的非AD 患者相比，AD 患者皮層中100 ～130 kDa的DISC1亞型水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 DISC1 在人腦中的表達情況Fig.1 Expression of DISC1 in the human brains

2.2 過表達DISC1 對突觸可塑性的影響與GFP組比較，GFP+Aβ組樹突棘數量減少，而DISC1+Aβ組較GFP+Aβ組樹突棘數量增多，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A、B。長時程增強（LTP）是突觸傳遞功能可塑性的重要評價指標。對海馬注射GFP 對照慢病毒及DISC1 過表達慢病毒的腦切片進行Aβ處理，膜片鉗檢測其LTP。結果顯示，GFP+Aβ組小鼠腦切片的LTP 較GFP 組減弱，而過表達DISC1 后再行Aβ處理，LTP 較Aβ+GFP 組增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2C、D。以上結果表明：DISC1 減弱了Aβ誘發的樹突棘喪失及對突觸可塑性的毒性作用。

2.3 過表達DISC1 對APP/PS1 轉基因小鼠腦內Aβ斑塊沉積的影響在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中注射GFP 對照及DISC1 過表達腺相關病毒，6 個月后，免疫熒光染色檢測各組小鼠腦皮層及海馬Aβ斑塊沉積情況。與TG+GFP 組比較，TG+DISC1組小鼠海馬老年斑面積明顯減少（P＜0.05），而兩組皮層的老年斑面積差異無統計學意義（P＞0.05），表明過表達DISC1 能改善APP/PS1 轉基因小鼠腦內Aβ斑塊的沉積。見圖3。

圖2 過表達DISC1 對突觸可塑性的影響Fig.2 Effects of overexpression of DISC1 on synaptic plasticity

圖3 過表達DISC1 對APP/PS1 小鼠海馬Aβ斑塊沉積的影響Fig.3 Effects of overexpression of DISC1 on Aβ plaque deposition in APP/PS1 transgenic mice

2.4 過表達DISC1 對APP/PS1 轉基因小鼠的學習記憶能力的影響在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中注射GFP 對照及DISC1 過表達腺相關病毒，6 個月后使用Morris 水迷宮評價各組小鼠學習記憶能力。各組小鼠尋找平臺逃避潛伏期隨著時間的延長逐漸縮短。在第5 天時，與WT + GFP 組比較，TG + GFP 組的逃避潛伏期更長（P＜0.05），而TG+DISC1 過表達組較TG+GFP 組的逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；同時在撤掉平臺后，與WT+GFP組比較，TG+GFP組穿越平臺的次數更少（P＜0.05），而TG + DISC1 過表達組較TG + GFP 組穿越平臺的次數多（P＜0.05），表明過表達DISC1 改善了APP/PS1 轉基因小鼠的學習記憶能力。見圖4。

3 討論

AD 是最常見的神經系統退行性疾病，主要表現為進行性的認知功能缺陷和行為能力障礙，嚴重影響患者日常生活水平，本病從明確診斷到患者死亡通常只有3 ～9年的時間。目前全球有超過5 000 萬AD 患者，而且患者數量還在不斷增加，給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔［11］。隨著人口老齡化的不斷加劇，AD 的發病率越來越高［1］。AD 病因復雜，且目前沒有確切的治療方法。因此，亟需探索其發病機制并尋找有效的治療方法。

圖4 Morris 水迷宮實驗檢測過表達DISC1 對APP/PS1 轉基因小鼠學習能力的影響Fig.4 Effects of overexpression of DISC1 on Morris water maze experiment in APP/PS1 transgenic mice

目前AD 的發病機制仍未完全闡明，其發病涉及多種分子的改變。以往的研究發現，DISC1 是包括精神分裂癥、重性抑郁和雙相精神障礙在內的多種精神疾病的遺傳風險基因［12-15］。最近幾年，DISC1 與AD 發病的關系越來越受到關注：ZHANG等［10］報道DISC1 與中國北方漢族AD 的發病存在相關性；SHAHANI 等［16］報道DISC1 可以調控淀粉蛋白前體APP 在細胞內的轉運；并且先前實驗也證實，DISC1 在8 個月的AD 小鼠腦中低表達［17-18］。由于存在可變剪接，DISC1 具有多種亞型。 在蛋白質水平上，檢測到的大多數DISC1 亞型在100 ～130 kDa 之間，這些是其發揮主要作用的亞型。在70 ～85 kDa 處也觀察到較小的DISC1 亞型。本研究中發現，DISC1 在AD 患者大腦中的表達較年齡性別相匹配的非AD 患者的表達水平更低，提示DISC1 可能是一個與AD 發病相關的重要因子。

腦內Aβ斑塊的形成與異常沉積是導致AD 病理進展的一個關鍵因素，腦內Aβ斑塊的沉積可導致神經元樹突棘喪失，神經突觸進行性減少，最終導致AD 患者學習記憶能力下降。樹突棘（dendrit?ic spine）是樹突分枝上的棘狀突起，是神經元間形成突觸的主要部位。在學習記憶過程中，突觸可塑性常與樹突棘的形成、脫落、擴張和萎縮等形態變化相伴發生。本研究將培養的原代胎鼠神經元進行Aβ處理，體外模擬Aβ對神經元的毒性作用，結果發現過表達DISC1 能夠挽救Aβ造成的樹突棘的喪失及長時程增強（LTP）的抑制，提示DISC1 在AD 的發病過程中可能通過改善突觸的可塑性發揮延緩AD 進展的作用。

目前，大量的基礎研究致力于減少Aβ生成而改善AD 患者的學習記憶能力［19-20］。先前的研究中發現，在4月齡的APP/PS1 小鼠海馬中（此時海馬中尚未有明顯的Aβ斑塊形成）過表達DISC1，8月齡時檢測，其可以有效減少Aβ斑塊的沉積，并提高AD 小鼠學習記憶能力。而在本研究中發現，在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中（此時海馬中已經有明顯的Aβ斑塊沉積）過表達DISC1，6 個月后檢測，其仍可以有效減少Aβ斑塊的沉積并提高其學習記憶能力。以上結果提示，過表達DISC1 不僅可以在早期預防腦內Aβ斑塊的沉積及改善其學習記憶能力，并且對已經有穩定Aβ斑塊沉積的AD 患者仍有減少Aβ斑塊沉積及改善其學習記憶能力的作用，其中涉及的更深入機制，需要在將來的研究中進一步探索。雖然本實驗在APP/PS1轉基因小腦內過表達DISC1，證明DISC1 有效減少了Aβ的生成，但其不能完全模仿生理狀態下沒有DISC1 作用時Aβ的生成情況，因此，在后續的實驗中希望能夠構建DISC1 的敲除鼠并將APP/PS1 小鼠與其雜交產生DISC1 敲除的APP/PS1 小鼠，從而進一步在體內研究DISC1 對AD 小鼠Aβ斑塊的形成。

綜上所述，腦內DISC1 水平下調可能是AD 發病的一個重要危險因子，過表達DISC1 能夠通過減少腦內Aβ斑塊沉積及減弱Aβ斑塊沉積造成的樹突棘喪失和LTP 抑制，從而提高AD 小鼠的空間學習記憶能力。本研究挖掘了DISC1 作為AD 治療靶點的潛能，為AD 的治療提供了理論基礎。