自噬相關蛋白在膿毒癥并發急性呼吸窘迫綜合征患者中的水平變化及臨床意義

何子純 張佳怡

重慶市紅十字會醫院（江北區人民醫院）呼吸內科（重慶400020）

膿毒癥是患者對嚴重感染反應失調引起的器官功能障礙綜合征，發病率為38～100/10 萬，病死率為22% ～55%［1］。由于膿毒癥患者全身處于炎癥激活狀態，其中1/3 的患者可能發展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［2］。盡管近年來在重癥監護及膿毒癥合并ARDS 的基礎與臨床相關研究方面，取得了一定進展，但患者病死率仍較高，其主要原因與膿毒癥并發ARDS 患者早期診斷率及病情變化評估不足有關。近年來研究顯示，細胞自噬參與了調控機體炎癥反應，在生理條件下，機體自噬處于動態平衡狀態，對于維持內環境穩態發揮了重要調控作用［3］。在器官功能損傷或障礙中，如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病患者，其自噬水平顯著降低，與患者體內炎癥水平呈顯著負相關［4-5］。對于膿毒癥并發ARDS 患者體內自噬水平如何，目前相關研究較少。因此，本研究旨在觀察自噬相關蛋白在膿毒癥并發ARDS 患者體內水平變化，探討自噬在該類疾病炎癥反應中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料以重慶市紅十字會醫院呼吸內科及重癥醫學科（2017年1月至2020年8月）就診的膿毒癥患者235 例為研究對象。納入標準：所有患者均滿足膿毒癥診斷標準［6］；年齡≥18 歲。排除標準：嚴重肝腎功能不全；惡性腫瘤；自身免疫性疾病；入院24 h內死亡的患者。其中男性125例，女性110 例，年齡31 ～79 歲，平均年齡（55.3 ± 9.4）歲。根據是否合并ARDS，分為ARDS 組（104 例）和非ARDS 組（131 例）。同時選擇我院行健康體檢人群40 例為對照組。ARDS 診斷參照2011年柏林定義標準［7］。根據ARDS 組患者28 d 預后水平，分為存活組（66 例）和死亡組（38 例）。該研究獲得本院倫理委員會批準，并征得了患者家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數據采集記錄患者一般臨床資料，包括性別、年齡、原發疾病、急性生理與慢性健康狀況評分（APACHE Ⅱ）、乳酸水平及28 d 病死率。

1.2.2 檢測自噬相關基因mRNA 水平入院即刻收集患者外周血，提取單個核細胞（PBMC），采用實時定量PCR 檢測自噬相關基因mRNA 水平。簡要方法如下，采用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）提取PBMC 中總的RNA，然后進行逆轉錄，逆轉錄方法按試劑盒說明（Takara 公司）。使用ABI Prism 7000 序列檢測系統（美國Bio?rad 公司）進行RT?qP?CR反應。本研究中使用的引物序列如下：Beclin?1，正向5′?GGCTGAGAGACTGGATCAGG?3′和反向5′?CTGCGTCTGGGCATAACG?3?3′；LC3?Ⅱ，正向5′?GAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGG?3′和反向5′?GTG?TCCGTTCACCAACAGGAAG?3′；p62，正向5′?GCT?CTTCGGAAGTCAGCAAACC?3′和反向5′?GCAGTT?TCCCGACTCCATCTGT?3′；GAPDH，正向5′?GGAC?TGACCTGCCGTCTAG?3′和反向5′?TAGCCCAGGA?TGCCCTTGAG?3′。以GAPDH 為內參，使用2-ΔΔCq方法計算相對mRNA 水平。

1.2.3 檢測自噬相關基因蛋白表達水平提取PBMCs 總蛋白，使用Bradford 方法測定蛋白濃度。每孔加入等量蛋白，通過10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉移置硝基纖維素膜。采用牛血清白蛋白封閉，然后與稀釋的一抗進行孵育，抗Beclin?1抗體（1∶500）、抗LC3 抗體（1∶500）抗p62 抗體（1∶400）及抗GAPDH 抗體（1∶800）。次日孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000）。以GAPDH 為內參，計算目的條帶與GAPDH 灰度比值。

1.2.4 檢測外周血細胞因子及乳酸水平采用ELISA 法測定不同組間外周血IL?1β、TNF?α、IL?6和IL?10 水平，具體操作依據試劑盒說明書（武漢博士德生物公司）進行。

1.3 統計學分析采用SPSS 19.0 進行數據分析。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。采用Spearman 相關性分析。運用Graphpad 軟件做ROC 曲線分析，計算ROC 曲線下面積（AUC）、最佳工作點（OOP）、敏感性及特異性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較ARDS 組患者血乳酸、APACHE Ⅱ評分及28 d 病死率顯著高于非ARDS組（P＜0.05）。ARDS 組和非ARDS 組患者在性別、年齡、采血時間、原發病等方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組間自噬相關蛋白及細胞因子水平比較與對照組比較，肺內疾病并發的ARDS 組、肺外疾病并發的ARDS組和非ARDS組PBMCs 中Beclin?1、LC3?II mRNA 及蛋白表達和外周血IL?10 水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05）。與非ARDS組比較，肺內疾病并發的ARDS 組、肺外疾病并發的ARDS 組PBMCs 中Beclin?1、LC3?II mRNA 及蛋白表達和外周血IL?10 水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05）。肺內疾病并發的ARDS組和肺外疾病并發的ARDS 組上述指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2 及圖1。

表1 各組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data in each group ±s，例（%）

表1 各組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data in each group ±s，例（%）

注：與非ARDS 組比較，*P ＜0.05

指標性別（男/女）平均年齡（歲）采血時間（min）原發病（例）重癥肺炎重癥胰腺炎腹腔感染膽道感染外科創傷其他乳酸（mmol/L）APACHEⅡ評分（分）28 d 病死率（%）對照組（40 例）21/19 55.10±7.28 1.20±0.34---------ARDS 組（104 例）55/49 55.65±8.19 2.60±0.48 25（24.1）21（20.2）20（19.2）15（14.4）13（12.5）10（9.6）8.92±1.81*18.94±3.13*38（36.5）*非ARDS 組（131 例）70/61 54.90±9.60 2.68±0.51 32（24.4）26（19.8）25（19.1）18（13.7）15（11.5）15（11.5）5.20±1.47 13.48±2.05 30（22.9）t，F/χ2值0.014 0.216 157.200 0.005 0.004 0.001 0.022 0.061 0.205 17.390 16.090 5.244 P 值0.993 0.806＜0.001 0.945 0.948 0.977 0.811 0.805 0.650＜0.001＜0.001 0.022

表2 各組患者自噬相關基因mRNA 及細胞因子水平比較Tab.2 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels in each group ±s

表2 各組患者自噬相關基因mRNA 及細胞因子水平比較Tab.2 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與非ARDS 組比較，#P ＜0.05

組別對照組非ARDS 組肺內疾病并發ARDS 組肺外疾病并發ARDS 組F 值P 值例數40 131 25 79 Beclin?1 mRNA 1.03±0.13 0.83±0.10*0.64±0.19*#0.62±0.17*#94.95＜0.001 LC3?II mRNA 1.05±0.10 0.86±0.13*0.70±0.18*#0.68±0.15*#74.70＜0.001 p62 mRNA 1.02±0.11 1.79±0.15*2.14±0.22*#2.18±0.18*#491.00＜0.001 IL?1β（pg/mL）10.20±3.28 28.82±5.65*39.10±6.83*#40.02±7.24*#238.80＜0.001 TNF?α（pg/mL）8.40±2.60 22.12±4.80*30.26±6.04*#30.64±5.50*#202.10＜0.001 IL?6（pg/mL）14.12±3.50 30.40±4.58*36.65±5.10*#37.04±6.03*#204.10＜0.001 IL?10（pg/mL）29.50±4.20 18.90±3.10*13.60±3.28*#13.35±2.97*#236.60＜0.001

2.3 不同ARDS 預后組間自噬相關蛋白及細胞因子水平比較與存活組比較，死亡組PBMCs 中Beclin?1、LC3?ⅡmRNA 及蛋白表達和外周血IL?10水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05），見表3。

2.4 相關性分析ARDS組患者Beclin?1mRNA與外周血IL?1β和TNF?α水平呈負相關（IL?1β：r=-0.846，P＜0.001；TNF?α：r=-0.735，P＜0.001）；LC3?II mRNA 與外周血IL?1β和TNF?α水平也呈負相關（IL?1β：r=-0.416，P＜0.001；TNF?α：r=-0.359，P＜0.001），p62 mRNA 與外周血IL?1β和TNF?α水平也呈正相關（IL?1β：r=0.856，P＜0.001；TNF?α：r=0.524，P＜0.001），見圖2。

2.5 ROC 曲線分析ROC 曲線分析表明，Beclin?1 mRNA 區分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.818（95%CI：0.743 ～0.913），敏感性和特異性分別為75.96%和80.49%，最佳的臨界點是0.54。而LC3?ⅡmRNA 區分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.829（95%CI：0.738 ～0.921），敏感性和特異性分別為81.82%和75.61%，最佳的臨界點是0.57。p62 mRNA 區分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.794（95%CI：0.705 ～0.883），敏感性和特異性分別為71.19%和71.23%，最佳的臨界點是2.23，見圖3。

3 討論

圖1 各組患者自噬相關基因蛋白表達水平比較Fig.1 Comparison of protein expression levels of autophagy?related genes in each group

膿毒癥為患者機體對感染的反應失調引起的器官功能障礙，其主要特征為機體合成與釋放大量炎性細胞因子［8］。過度的炎癥反應和活性氧，導致線粒體功能障礙，隨后引起器官功能衰竭［9］。肺是膿毒癥損傷的主要靶器官之一，一旦并發ARDS，患者病死率會顯著升高［10］。目前，對于膿毒癥并發ARDS的早期識別和預后評估的生物標志物較少。有部分研究顯示，如與單獨使用肺損傷預測評分相比，聯合血漿血管生成素?2可有效的提高早期ARDS 的預測值［11］；尿酸與ARDS 患者病死率呈正相關，通過檢測尿酸水平，對于預后的評估有一定價值［12］。但目前這些生物標記物的相關臨床研究證據仍偏少，并未在臨床得到廣泛開展與運用。

相關研究［13-14］顯示，自噬參與了炎癥性疾病的發生、發展過程，對于疾病的診斷及病情的評估有一定的運用前景。自噬是一種細胞內降解途徑，細胞通過該途徑回收細胞質并降解過量或缺陷的細胞器，維持體內穩態［15］。動物研究［16］結果表明，自噬在感染性損傷后會短暫性的升高，但隨后表達及活性水平顯著受到抑制。在膿毒癥引起的肝損傷中，自噬水平與肝功能障礙、肝細胞損傷及細胞凋亡程度密切相關，自噬水平的降低可能是導致膿毒癥肝衰竭的主要原因之一［17］。因此，自噬成為炎癥性疾病治療的重要靶標，通過維持或增加體內自噬水平，同時消除抑制自噬的因素是重要的治療策略［18］。對于膿毒癥并發ARDS 患者中，自噬表達水平如何，相關研究較少。本研究結果顯示，與膿毒癥組比較，膿毒癥并發ARDS 患者體內自噬水平顯著降低，而炎癥指標顯著升高，提示膿毒癥并發ARDS患者體內自噬處于抑制狀態。在臨床實踐中，生物標志物不僅用于疾病的早期診斷及病情嚴重性評估，還可預測臨床結局。對于膿毒癥并發ARDS 患者預后水平的預測，相關臨床研究也提出了部分生物學標記物，如C?反應蛋白、降鈣素原等，但特異性均偏低。本研究結果顯示，死亡組患者體內自噬水平顯著低于存活組患者，ROC 曲線發現，自噬相關蛋白對于膿毒癥并發ARDS患者預后評估的敏感性和特異性均較高，表明其可能成為預測膿毒癥并發ARDS患者預后不佳的有效指標。較低的自噬水平，促進了炎癥反應的放大。研究顯示，表觀遺傳學機制包括基因甲基化、組蛋白修飾、mi?croRNA等參與了調控自噬［19-20］，對表觀遺傳學在自噬調控方面的深入研究，將有助于探索出針對炎癥性疾病如膿毒癥并發ARDS 患者新的治療策略。本研究局限性在于：（1）可能存在膿毒癥并發ARDS確診偏低的情況，有患者ARDS癥狀不明顯，存在漏診發生可能；（2）樣本量偏低，對研究結果產生偏倚；（3）所有患者均來自同一醫院，多中心隨機雙盲研究將有助于更好的進行評估。

表3 兩組患者自噬相關基因mRNA 及細胞因子水平比較Tab.3 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels between the two groups ±s

表3 兩組患者自噬相關基因mRNA 及細胞因子水平比較Tab.3 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels between the two groups ±s

注：與存活組比較，*P ＜0.05

組別存活組死亡組t 值P 值例數66 38 Beclin?1 mRNA 0.63±0.11 0.54±0.10*4.151＜0.001 LC3?ⅡmRNA 0.69±0.12 0.58±0.09*4.908＜0.001 p62 mRNA 2.10±0.18 2.26±0.20*4.190＜0.001 IL?1β（pg/mL）38.82±4.62 42.10±5.10*3.356 0.001 TNF?α（pg/mL）26.20±4.02 32.58±4.95*7.153＜0.001 IL?6（pg/mL）35.80±4.30 39.26±4.60*3.382＜0.001 IL?10（pg/mL）13.82±2.10 11.70±2.36*4.737＜0.001

圖2 相關性分析Fig.2 Correlation analysis

圖3 各指標ROC 曲線分析Fig.3 ROC curve analysis of each indicator

綜上所述，本研究結果顯示，自噬水平的降低參與了膿毒癥并發ARDS的發生及發展，通過檢測自噬水平，對患者預后不佳的評估具有一定臨床價值。