p53 Arg72pro基因多態性與宮頸癌放化療敏感性的相關性

張紅麗 魯亮 曹輝 方春菊 朱海振 李勇

貴州省人民醫院腫瘤科（貴陽550002）

宮頸癌是發病率最高的婦科惡性腫瘤，嚴重影響著女性的生命健康［1］。中國的宮頸癌發病率是發達國家的6 倍，造成了嚴重的社會負擔［2］。由于尚無特異性早期癥狀，超過60%的患者初診時即診斷為局部晚期宮頸癌，同期放化療為NCCN指南推薦標準治療模式，但其中29%～38%的失敗模式是未控或復發，而復發患者的5年生存率僅為3.8%～13%［3］。研究顯示，放化療抵抗是腫瘤未控或復發的主要原因［4］。因此，如何在治療前預測患者對放化療的敏感性，對于指導后續治療顯得尤為重要。

p53 基因是目前發現與人類腫瘤最相關的一種抑癌基因［5］，其在DNA 合成修復、細胞周期調控以及基因組的完整性等方面發揮著重要作用。p53 基因結構的改變已被發現與多種腫瘤的發生有關，大約50%的惡性腫瘤中發現有p53 基因的突變［6］。p53 基因72 密碼子的多態性（Arg72pro，rs1042522 C ＞G）與惡性腫瘤發生的關系是近年的研究熱點，目前已報道p53 Arg72pro 與胃癌［7］、乳腺癌［8］、肺癌［9］、卵巢癌［10］等發生均存在顯著關聯性。ROSHANI 等［11-12］研究發現p53 基因72 位密碼子Arg/Arg 基因型是宮頸癌的預后風險因素。P53基因的過度表達可降低射線敏感性，且不同基因型可表現出不同的射線敏感性。本研究擬通過檢測宮頸癌患者p53 Arg72pro 基因多態性與宮頸癌放化療敏感性的關系，揭示p53 不同基因型對宮頸癌放化療敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取貴州省人民醫院腫瘤科2013年1月至2016年3月收治的宮頸癌患者105 例為研究對象，年齡為25～74 歲，平均（51 ± 10）歲。中位隨訪時間為6 個月。該研究已通過醫院倫理委員會的批準。研究納入標準：（1）病理組織學證實為宮頸癌；（2）FIGO 2009 分期為ⅡB?ⅣA 期；（3）年齡為18～80 歲；（4）ECOG 評分為0～2 分；（5）接受并完成根治性同期放化綜合治療；（6）有完整病例及隨訪資料者。排除標準：（1）復發或有遠處轉移患者；（2）放療未完成者；（3）接受與宮頸癌治療相關手術治療者，但不包括介入止血、介入灌注化療者。

1.2 治療及隨訪同期放化療期間兩組患者均采用直線加速器（瑞典醫科達公司設備型號：VER?SA HD）產生的6MV?X 線行圖像引導下的調強放療（IGRT），總劑量45 Gy/1.8 Gy/25 f，2 ～3 周后每周使用Ir192 高劑量率后裝治療機（荷蘭核通公司 設備型號：Microselectron）腔內放療，6 Gy×5 f，與外照射相加等效劑量為85 Gy。體外放療和腔內放療期間給予順鉑40 mg/m2/W（5 療程）。

經治患者在同步放化療后定期隨訪，復查影像學（兩種以上影像學檢查或宮頸刮片病理，有條件者可行全身PET?CT 檢查），測量腫瘤體積改變及明確有無復發和轉移。

1.3 放化治療敏感性評估根據患者同步放化療后4 周的療效評價結果，將宮頸癌同步放化療療效分為高敏感（CR + PR）和低敏感組（PD + SD）。療效評定標準采用實體瘤RECIST 標準（1.1 版）［13］評價療效。

1.4 基因多態性檢測采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的完整性、采用微量分光光度計檢測DNA的濃度。采用PCR熒光探針法對研究對象進行SNP 位點基因分型檢測，p53 Arg72pro（rs1042522）基因位點的檢測均設計3 條引物，包括2 條上游引物和1 條下游引物，其中2 條上游引物均在3′端的末位根據不同的SNP 堿基給予不同的錯配，共用下游引物。根據NCBI 網站上公布的DNA全序列信息，在Primer Designer 6.0 版輔助下，自行設計引物，由Life 公司合成。P53 Arg72pro 上游引物為5′?CCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCG?3′，5′?CCAG?AATGCCAGAGGCTGCTCCCCC?3′，下游引物為5′?AGGAGCTGCTGGTGCAGGGGCCACG?3′。PCR反應體系為10 μL，PCR 反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環40 次，72 ℃延伸2 min，觀察結果。

1.5 統計學方法采用確切概率分析法檢驗Hardy?Weinberg 平衡；采用單因素和多因素logistic 回歸分析進行放化療敏感性影響因素篩選。所有統計學運算和制圖均通過Prism 8.0（GraphPad Software，San Diego）進行。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因分布頻率及Hardy?Weinberg平衡檢驗經SNP 檢測，p53 Arg72pro C/C 基因型合計31 例，C/G基因型合計47例，G/G基因型合計27例。Hardy?Weinberg 平衡檢驗顯示總體符合Hardy?Weinberg平衡，敏感或不敏感組患者均符合Hardy?Weinberg平衡（表1）。說明該群體基因可靠，具備群體代表性。

表1 p53 Arg72pro 基因分布頻率及Hardy?Weinberg 平衡檢驗Tab.1 Frequency of gene distribution of p53 Arg72pro and Hardy?Weinberg balance test 例

2.2 基因多態性與放化療敏感性單因素相關分析基于Codominant、Dominant、Recessive 和Over?dominant 的基因多態性與放化療敏感性單因素相關分析模型顯示，C/G 和G/G 的患者放化療敏感性比例高，是保護性基因。與C/C 基因型相比，不敏感的可能性降低一半以上（0.43），但四種模型結果差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

2.3 與宮頸癌放化療敏感性相關logistic 回歸分析單因素logistic 回歸分析結果顯示Ⅲ～Ⅳ期、低分化和淋巴結轉移會明顯降低放化療的敏感性（P＜0.05，表3）。經年齡、分期、分化程度、腫瘤大小及淋巴結轉移等因素校正后，多因素logistic 回歸結果顯示：p53 Arg72pro 基因型是宮頸癌同步放化療的獨立影響因素，其中C/G 基因型顯著增加了宮頸癌放化療敏感性。

表2 p53 Arg72pro 基因多態性與放化療敏感性單因素相關分析Tab.2 Univariate analysis for genetic polymorphism of p53 Arg72pro with chemoradiation sensitivity 例（%）

表3 影響宮頸癌放化療敏感性的logistic 分析結果Tab.3 Logistic analysis of clinical factors for chemoradiation sensitivity

3 討論

p53 基因在宮頸癌的發生發展過程中起到了非常重要的作用，其突變可改變靶基因轉錄活性、抑制凋亡、抑制放化療敏感性以及抑制p53 家族成員（p63、p73）功能等，從而促進腫瘤進展［14］。研究發現p53 蛋白突變體可抑制DNA 雙鏈斷裂反應信號通路，增加基因組不穩定性，促進腫瘤發生。由此可見，p53 基因可作為研究腫瘤放射敏感性的一個突破口［14-15］。WANG 等［16］收集52 例宮頸鱗癌患者放療前后活檢標本，并檢測p53 蛋白表達情況，發現放療前高表達p53 蛋白的宮頸癌患者具有較差的預后，同時放療可誘發p53 基因突變，產生穩定且有更長半衰期的p53 蛋白突變體表達，致使宮頸癌患者預后進一步惡化。而對于其具體的影響機制，有研究顯示，p53 可通過乙酰化/去乙酰化調節應答射線引起的DNA 損傷等遺傳毒性，進而影響放射敏感性等表型變化。

在本研究中，納入研究的宮頸癌患者Ⅲ～Ⅳ期比例較高（23.8%），這可能說明貴州地區女性對該病知曉率不高，拖延診治時間，致使腫瘤進展到較晚期。單因素相關性分析顯示，年齡、分期、分化程度、腫瘤大小以及是否淋巴結轉移等均是放化療敏感性的相關影響因素：相比于年輕患者，年齡更長的患者對放化療敏感度更低；相對于ⅡB 期患者，Ⅲ～Ⅳ期患者的放化療敏感性較低；腫瘤低分化和淋巴結轉移均降低了放化療敏感性。腫瘤分期及腫瘤大小在單因素相關中發現與放化療敏感性相關，但多因素分析中未發現與放化療敏感性存在顯著相關。這一現象說明在腫瘤分期的相關性方面摻雜了其他混雜因素造成了假性關聯，這可能是由于淋巴結轉移等其他因素混雜引起的。放療和化療聯合是宮頸癌常見的治療方式，對二者的敏感性均由不同因素控制，兩者的混雜本身就給研究帶來了一些復雜性。前期一些研究表明增殖活躍的細胞比不增殖的細胞對放射敏感，細胞分化程度越高放射敏感性越低，反之愈高［17-18］。在臨床中筆者也發現，雖然有些患者宮頸癌已達Ⅲ～Ⅳ期，對于中、低分化及相對年輕的患者，放化療仍然有較好的效果。大部分鱗癌屬中度放射敏感，而大部分腺癌的放射敏感性與細胞的分化程度相關［19］。可見，傳統的臨床病理特征并不能準確反映放化療的敏感性，對于上述某一臨床病理因素相同的患者，在采用標準的同步放化療治療方案后，其預后仍存在有很大差別。因此，進一步豐富臨床指標來評估和預測放化療敏感性是研究熱點，而p53 基因多態性就可成為潛在的評估放化療敏感性因素。本研究中納入的人群p53 Arg72pro基因位點檢測都符合Hardy?Weinberg 平衡，具備群體代表性。本研究結果顯示，C/G 和G/G 的患者對放化療更敏感，屬于保護性基因；而C/C 基因型則為危險基因，會降低放化療敏感性。這與之前研究的C/C 基因型為易患癌基因有一定相似性，說明p53 Arg72pro 位點C/C 基因型不僅增加患癌風險，也對放化療有一定抵抗。

本研究存在一定的局限性，首先，納入分析的樣本量較有限，會對分析結果造成一定的偏倚，但是本文在探究p53 基因型與放化療敏感性關系的同時，也納入考慮多個臨床因素并進行校正，因此本文的分析結論具有一定的可靠性。同時，考慮到本研究使用療效評價指標判定放化療敏感性，而缺少相關實驗室指標，如Fas、Fasl、Cox?2 等，以及p53 基因型對患者的順鉑化療的敏感性如何尚無法明確，因此需要后續細胞及分子生化水平探究明確。其次，本研究納入的患者局限在本院，并且大部分來自貴州地區，存在潛在的研究人群方面的選擇偏倚，即對于其他地區的宮頸癌患者是否適用本研究結論，尚需要進一步探究。再次，lo?gistic 模型未經外部隊列驗證，因此，模型預測的穩健性仍需要進一步驗證。