miR-623靶向DNM2調控非小細胞肺癌細胞A549的凋亡研究

許峰 劉聞 陳宇 方漢林 左劍輝

安徽醫科大學第一附屬醫院普胸外科,合肥230022

作為世界上最常見的惡性腫瘤之一,肺癌已成為世界范圍內與癌癥相關的第一大死亡原因[1]。小細胞肺癌占20%,非小細胞肺癌占80%[2]。大約85%～90%的肺癌死亡是由非小細胞肺癌引起的,其分子機制是復雜和異質性的[3]。近年來,非小細胞肺癌的治療進展迅速,使人們對其病理機制、腫瘤轉移的分子機制、治療和預后有了進一步的認識,診斷和治療的改進也大大延長了肺癌患者的生存期。然而非小細胞肺癌的新分子治療選擇靶點的識別仍然十分有限,需要對肺癌發生、發展過程中涉及的異常基因表達進行精確的分子表征,這可能在未來提高臨床療效。了解非小細胞肺癌發生、發展的機制可能會對臨床實踐產生重大影響。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類豐富的非編碼18～25核苷酸小RNA,與特異性靶m RNA的3'-UTR結合,通過誘導翻譯抑制或m RNA降解來抑制基因表達。miRNAs參與多種生物學過程,如細胞周期進展、增殖、生長和凋亡。特殊miRNAs的異常表達是包括非小細胞肺癌在內的許多人類腫瘤類型的標志,它們既可以作為癌基因,也可以作為腫瘤抑制因子。例如,miRNA-143在肺癌細胞中表達被強烈下調,導致c-MYC、NUDT1、OCT4和EGFR表達升高,腫瘤細胞生長、轉移和遷移增加[4]。相比之下,miRNA-21在包括非小細胞肺癌在內的不同癌癥中過表達,導致PTEN抑制,細胞生長和侵襲增加[5-6]。因此,miRNAs可以作為肺癌診斷、預后和治療的潛在有用的生物標志物。Nigita等[7]發現非小細胞肺癌中多種miRNA失調,包括miR-623,但miR-623對非小細胞肺癌的調控機制還需要進一步的研究。細胞凋亡在大多數多細胞生物的發育過程和組織穩態中起重要作用;在許多疾病狀態的發病機制和進展過程中,細胞凋亡的異常已經被證實。在非小細胞肺癌中,細胞凋亡的平衡被打破。然而,miR-623是否與凋亡相關仍未探明。基于此,本研究使用A549作為研究對象,旨在探討miR-623調控非小細胞肺癌細胞A549凋亡的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌細胞A549購自深圳益百順科技有限公司(貨號:A549)。用合成的寡核苷酸和pCMV載體構建pGCV-DNM2表達質粒(pCMV-DNM2)。Lipo2000購自北京斯科科技有限公司(貨號:11668027-0.75)。miR-623過表達、miR-623抑制、siDNM2和siGFAP均由北京擎科生物科技有限公司合成。RPMI-1640培養基購自北京普益華科技有限公司(貨號:R8005-10X1L)。pmir-glo utr1質粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨號:JG190917001M)。GAPDH抗體購自廣州左克生物科技發展有限公司(貨號:WB2197)。DNM2抗體購自廣州文睿科學儀器有限公司(貨號:DF12953)。胎牛血清購自廣州左克生物科技發展有限公司(貨號:HQ30071)。TRIzol試劑購自廣州齊云生物技術有限公司(貨號:B610409-25 ml)。HiScriptqRTSuper Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號:R122-01)。Cham Q SYBR qPCR Master Mix購自廣州捷威斯生物科技有限公司(貨號:Q331-02)。RIPA總蛋白裂解液購自廣州捷威斯生物科技有限公司(貨號:RBG2007-1)。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自北京華夏遠洋科技有限公司(貨號:C1065)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 人非小細胞肺癌A549細胞培養在RPMI-1640中,并且補充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素。非小細胞肺癌A549細胞在濕潤的含5%二氧化碳的37℃培養箱中培養。使用Lipofectamine 2000進行轉染,將pGCV-DNM2、陰性對照載體、miR-623過表達、miR-623抑制、siDNM2和siGFP分別與Lipofectamine 2000混合后,在室溫下放置15 min后,緩慢滴入A549細胞中,轉染6 h后更換新鮮的完全培養基。

1.2.2 免疫印跡 使用RIPA緩沖液從非小細胞肺癌A549細胞中提取總細胞蛋白,然后在4℃的條件下12 000 r/min離心20 min,離心半徑15 cm。隨后收集上清液。使用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒測量這些蛋白質樣品的濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離蛋白質樣品(每個泳道30μg),然后轉移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與DNM2(稀釋比為1∶2 000)或GAPDH(稀釋比為1∶5 000)第一抗體在4℃下孵育過夜。第2天,將膜與耦聯了辣根過氧化物酶的相應抗小鼠或抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。蛋白質條帶使用Western Bright ECL試劑盒(相同體積的A液和B液混合后緩緩滴在硝酸纖維素膜上),然后使用ChemiDocTMXRS+系統進行可視化。

1.2.3 RNA抽取與實時熒光定量PCR 用TRIzol試劑提取來自于非小細胞肺癌A549的總RNA。使用HiScriptqRTSuper Mix從2μg總RNA中進行互補脫氧核糖核酸的反向轉錄。qRTPCR采用Cham Q SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行。GAPDH作為內部對照。反應在96孔平板上進行:95℃孵育10 min,40個循環(95℃孵育15 s,60℃孵育1 min),所有反應重復3次。反應后,使用固定閾值設置確定循環閾值(cycle threshold,CT)數據,并從重復3次PCR中確定平均CT。采用對比CT法將每種情況與對照組進行比較。miRNAs的相對水平使用U6小核RNA歸一化。使用2-ΔCT公式計算miRNA的相對表達水平,ΔCT=(CT miRNA-CT GAPDH)。

1.2.4 細胞凋亡水平的檢測 根據制造商的說明,使用Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒對不同處理的

細胞進行凋亡分析。簡而言之,經過不同處理后,收集在6孔板上生長的漂浮非小細胞肺癌A549細胞和胰蛋白酶分離的細胞,并用冷的1×PBS洗滌。然后將細胞沉淀物用結合緩沖液重懸,并根據試劑盒方案用Annexin-V染色。熒光顯微鏡觀察。將實驗組中凋亡細胞的百分比與對照轉染組進行比較。所有樣品一式三份測量。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 使用miRDB在線預測miR-623潛在的靶基因,初步鑒定出目標基因為DNM2。從人非小細胞肺癌A549的cDNA文庫中擴增出DNM2 3'-UTR的野生型序列。miR-623結合位點的突變是通過快速突變試劑盒定點突變引入的,將堿基c突變為g。PCR產物被克隆到pmir-glo utr1質粒上。通過雙熒光素酶報告基因試劑盒進行熒光素酶活性的檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0進行分析。所有數據均以±s表示。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-623對非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平的影響 非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平為(21.2±6.5)%,使用miR-623過表達組過表達miR-623后,發現非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平為(8.3±1.8)%,下降至原來的39.2%(t=3.313,P＜0.05);抑制miR-623后,發現非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平為(70.6±8.9)%,上升至原來的3.3倍(t=7.764,P＜0.05)。

2.2 miR-623與DNM2的相關性 通過miRDB在線分析,發現miR-623潛在靶向TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、DNM2、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2。過表達miR-623后,發現與對照組相比,非小細胞肺癌細胞A549中DNM2的表達水平下降至原來的35.0%(t=5.418,P＜0.05),而TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2的表達水平均無顯著變化(P值均＞0.05),見表1。抑制miR-623后,發現與對照組相比,非小細胞肺癌細胞A549中DNM2的表達水平上升至原來的1.47倍(t=2.898,P＜0.05),而TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2的表達水平均無顯著變化(P值均＞0.05),見表2。通過熒光素酶報告實驗發現miR-623靶向DNM2的3'端非編碼區,見圖1。

表1 過表達miR-623后2組相關基因的相對表達水平(±s)

基因 對照組相對表達水平miR-623過表達組相對表達水平 t值 P值TRIM44 1.05±0.30 1.01±0.22 0.232 8 0.827 4 FOXN2 0.65±0.12 0.55±0.02 1.424 0 0.227 6 PTPRD 1.49±0.40 1.44±0.32 0.169 1 0.874 0 KLF3 0.95±0.29 0.99±0.30 0.166 0 0.876 2 DNM2 1.42±0.31 0.42±0.10 5.317 1 0.006 0 EPHB6 1.48±0.39 1.44±0.39 0.125 6 0.906 1 AP3M2 0.41±0.10 0.45±0.09 0.515 0 0.633 7 BIRC2 2.09±0.53 2.08±0.52 0.023 3 0.982 5 PHF6 0.49±0.11 0.51±0.10 0.233 0 0.827 2 FBN2 0.29±0.08 0.33±0.05 0.734 4 0.503 4

表2 抑制miR-623后2組相關基因的相對表達水平(±s)

表2 抑制miR-623后2組相關基因的相對表達水平(±s)

基因 對照組相對表達水平miR-623抑制組相對表達水平 t值 P值TRIM44 1.05±0.30 1.09±0.34 0.152 8 0.886 0 FOXN2 0.65±0.12 0.61±0.28 0.227 4 0.831 2 PTPRD 1.49±0.40 1.52±0.48 0.083 1 0.937 7 KLF3 0.95±0.29 0.97±0.23 0.093 6 0.929 9 DNM2 1.42±0.31 2.04±0.02 3.457 0 0.025 9 EPHB6 1.48±0.39 1.49±0.38 0.031 8 0.976 1 AP3M2 0.41±0.10 0.43±0.10 0.244 9 0.818 5 BIRC2 2.09±0.53 2.02±0.53 0.161 8 0.879 3 PHF6 0.49±0.11 0.48±0.11 0.111 3 0.916 7 FBN2 0.29±0.08 0.27±0.13 0.226 9 0.831 6

圖1 miR-623對野生型或突變型DNM2 3'端非編碼區活性的影響

2.3 DNM2對非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平的影響 通過siDNM2敲低DNM2后,發現與對照組比較,非小細胞肺癌細胞A549的凋亡下降至原來的26.7%(t=7.381,P＜0.05)(圖2)。

圖2 敲低DNM2對非小細胞肺癌細胞A549凋亡水平的影響 A:敲低DNM2的表達情況;B:敲低DNM2后非小細胞肺癌細胞A549的凋亡情況

通過DNM2質粒過表達DNM2后,發現與對照組比較,非小細胞肺癌細胞A549的凋亡上升至原來的3.66倍(t=4.113,P＜0.05)(圖3)。

圖3 過表達DNM2對非小細胞肺癌細胞A549凋亡水平的影響 A:DNM2質粒過表達后DNM2的表達情況;B:DNM2質粒過表達后非小細胞肺癌細胞A549的凋亡情況

同時敲低miR-623和DNM2,與對照組(同時轉染空載體和陰性對照載體)相比,非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平無明顯變化(t=0.626,P＞0.05),見圖4;同時過表達miR-623和DNM2,與對照組(同時轉染siGFP和陰性對照載體)相比,非小細胞肺癌細胞A549的凋亡水平無明顯變化(t=0.751,P＞0.05),見圖5。

3 討論

肺癌是世界范圍內最常見的癌癥死亡原因之一,嚴重危害著人類的健康和生命[8-9]。盡管相關治療取得了快速進展,非小細胞肺癌患者的預后仍然不容樂觀[10],肺癌患者的5年生存率較低,與其他癌癥相比,肺癌治療效果有限。這種有限療效的一個主要原因是肺癌對放療和/或化療的固有或獲得性耐藥。因此,探索新的有效的診斷和治療靶點是很重要的。為了開發更有效的診斷和治療技術,迫切需要更好地了解導致非小細胞肺癌癌變的分子生物學改變的遺傳改變。有必要從分子水平研究肺癌細胞的抗凋亡作用,闡明肺癌的基本分子機制。因此,探索新的有效的診斷和治療靶點是很重要的。為了開發更有效的診斷和治療技術,迫切需要更好地了解導致非小細胞肺癌癌變的分子生物學改變的遺傳改變。

圖4 抑制miR-623和DNM2對非小細胞肺癌細胞A549凋亡水平的影響

圖5 過表達miR-623和DNM2對非小細胞肺癌細胞A549凋亡水平的影響

miRNAs是一類小的非編碼RNA(21～25個核苷酸),其在非小細胞肺癌的幾乎所有方面發揮作用,如增殖、凋亡、侵襲/轉移和血管生成[11-12]。在本研究中,發現miR-623的表達能夠抑制非小細胞肺癌細胞A549的凋亡,隨后通過miRDB在線分析miR-623的潛在底物m RNA,發現miR-623的潛在靶標——DNM2,并通過實驗驗證確認了miR-623對非小細胞肺癌細胞A549中DNM2的表達抑制作用,并進一步探明miR-623對DNM2的抑制作用是通過靶向其3'端非編碼區來實現的。盡管本研究通過miRDB和熒光素酶報告系統發現miR-623的底物DNM2,然而miR-623是否有其他底物,并且這些底物在非小細胞肺癌的發生、發展中是否發揮生物學功能仍然值得進一步探究。

DNM2是GTP結合蛋白的一個亞家族,在生物過程中介導膜的分裂和融合,如內吞作用、囊泡運輸、細胞分裂和細胞器分裂。DNM2在胞吞作用機制中起兩種作用:一種是內吞囊泡收縮的早期作用,另一種是內吞囊泡破裂的晚期作用。目前發現DNM2是網格蛋白介導的內吞作用所必需的[13]。除此之外,DNM2還參與了其他細胞過程,如:通過與肌動蛋白結合蛋白相互作用來調控肌動蛋白的組裝和重組阻斷Na+/H+交換器以促進心肌細胞凋亡[14]。DNM2是一種新的連接蛋白伴侶,通過一種創新的機制模型,DNM2可以控制連接蛋白43縫隙連接斑塊的內陷、內吞、循環和降解[15]。此外,DNM2是氧化應激蛋白的新搭檔,可能在氧化損傷過程中發揮基礎性作用[16]。Fish等[17]報道,DNM2可能主要負責過表達的p53促進的凋亡,DNM2是p53上游信號通路的一部分,可以激活轉錄因子p53,潛在地觸發凋亡。此外,Gao等[18]也發現DNM2能夠促進活性氧產生和Ca2+的堆積,最后促進細胞凋亡。

本研究發現DNM2能夠促進非小細胞肺癌細胞A549的凋亡,因此激活DNM2可能促進非小細胞肺癌細胞的凋亡。本研究同時發現DNM2的表達受到miR-623的負調控,抑制miR-623能夠上調DNM2的表達,從而促進非小細胞肺癌細胞A549的凋亡。因此,miR-623可能是非小細胞肺癌治療的潛在靶標,靶向miR-623可能成為治療非小細胞肺癌患者的一種可能的替代方案。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突