芋螺毒素Lt14a的化學合成和穩定性研究

吳赟，曹錕

（廣東醫科大學 廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 523808）

芋螺是一類海洋無脊椎動物，目前大約發現有700多種[1-2]。芋螺的毒管組織可以產生毒液，以捕獲獵物或防御天敵[3-4]。芋螺毒液的主要有效成分是一些通常包括12～50個氨基酸殘基和1～5對二硫鍵的多肽，這些多肽被稱為芋螺毒素[5,6]。芋螺毒素是功能多樣的分子，可以選擇性地靶向不同亞型的神經遞質或離子通道受體，通常被用于神經科學研究的分子工具或臨床治療藥物[7-8]。芋螺毒素Lt14a（MCPLCKPSCTNC）含有13個氨基酸殘基，最早發現于信號芋螺的毒管cDNA文庫[9]。在此前的研究中發現，Lt14a可抑制疼痛，并且對人類細胞的毒性很低[10]；Lt14a以神經元煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）為靶點，在被測濃度下不會誘導藥物依賴[11]。作為一種潛在的鎮痛化合物，目前Lt14a已經進入了臨床前研究階段。為了能夠進一步的評價Lt14a的藥物性能，本研究合成了連續3個批次的Lt14a，并對樣品的穩定性進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 多肽合成

采用Fmoc法連續合成3批芋螺毒素Lt14a 多肽原料藥（樣品批號：20190301、20190302、20190303）[12-13]。通過全自動多肽合成儀（JB2014001，海南建邦）進行多肽的合成。從儀器上裂解下來的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下離心10 min。收集沉淀，進行冷凍干燥。取少量凍干后的粗肽溶解，經10 000×g離心2 min去除雜質后，上C18反相柱進行高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography, HPLC，Agilent 1200，美國安捷倫）檢測及純化。線性梯度洗脫，215 nm和280 nm處雙波長檢測。將HPLC收集的目標峰取1 μL，進行質譜檢測分析。確定多肽分子量正確后，用于后續實驗。根據質譜結果，收集HPLC純化后的目的峰，再次凍干。再經HPLC純化，經檢測達到95%以上純度后，第3次凍干成粉末，-20 ℃保存備用。

1.2 破壞性試驗

1.2.1 酸破壞性試驗

取3個批次的Lt14a樣品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1HCl 10 mL，振搖后室溫放置12 h，過濾，吸取20 μL進樣。根據HPLC譜圖，分別計算樣品和雜質的峰面積。

1.2.2 堿破壞性試驗

取3個批次的Lt14a樣品各5 mg，各加入0.1 mol·L-1NaOH 2 mL，振搖后室溫放置30 min，過濾，吸取20 μL進樣。根據HPLC譜圖，分別計算樣品和雜質的峰面積。

1.2.3 氧化破壞性試驗

取3個批次的Lt14a樣品5 mg，各加入10% H2O21 mL，振搖后室溫放置30 min，過濾，吸取20 μL進樣。根據HPLC譜圖，分別計算樣品和雜質的峰面積。

1.2.4 光照破壞性試驗

取3個批次的Lt14a樣品各5 mg，在4 500±500 Lx的光照條件下，在光照培養箱（PGX-280A-12H，寧波萊福）中放置7 d后，加入去離子水10 mL使其溶解并過濾，吸取20 μL進樣。根據HPLC譜圖，分別計算樣品和雜質的峰面積。

1.3 高溫高濕穩定性試驗

1.3.1 高溫穩定性試驗

精密稱取20190301批次芋螺毒素Lt14a樣品15份，每份10 mg，置于潔凈并精密稱重的西林瓶中攤平，將西林瓶開口置于濕度60%，溫度分別為40 ℃和60 ℃的恒溫恒濕培養箱（HSP-250B，上海坤天）中，分別于第0、5、10天各取樣3份，觀察外觀，并通過HPLC分析樣品含量。

1.3.2 高濕穩定性試驗

精密稱取20190301批次芋螺毒素Lt14a樣品15份，每份10 mg，置于潔凈并精密稱重的西林瓶中攤平，將西林瓶開口置于為溫度25 ℃，濕度分別為75%和90%的恒溫恒濕培養箱中，分別于第0、5、10天各取樣3份，觀察外觀，并通過HPLC分析樣品含量。

2 結果與討論

2.1 芋螺毒素Lt14a多肽原料藥的合成

采用多肽合成儀合成了3個批次（批號：20190301、20190302、20190303）的芋螺毒素Lt14a，使用HPLC對其進行了純化，最終Lt14a的樣品純度大于95%；通過質譜鑒定了Lt14a的分子量與預測值相符，可以用于后續試驗（圖1）。

圖1 芋螺毒素Lt14a（20190301批次）的HPLC純化圖（A）和質譜鑒定圖（B）

2.2 破壞性試驗結果

對3個批次的芋螺毒素Lt14a樣品分別進行酸、堿、氧化、光照破壞后，通過HPLC檢測破壞性試驗結果。將HPLC譜圖中的Lt14a樣品峰和雜質峰分別統計峰面積和百分率（表1）。從結果統計表中可以看出，經過12 h的酸破壞，共產生了4個雜峰，而Lt14a樣品峰面積依然大于88%。但是經過30 min的堿和氧化破壞后，Lt14a樣品峰面積只有85%左右。長時間的光照對于Lt14a的影響則不是很大，樣品峰面積都大于95%。

表1 芋螺毒素Lt14a的破壞性試驗結果

2.3 穩定性試驗結果

2.3.1 高溫穩定性試驗結果

將芋螺毒素Lt14a樣品在正常濕度下，分別放置于40 ℃和60 ℃的環境中5 d和10 d之后，觀測其外觀形狀依然保持為白色結晶性粉末，無明顯變化。稱重后發現，重量略有下降。HPLC檢測含量后發現，樣品含量有所下降，但是依然大于95%。

表2 芋螺毒素Lt14a的高溫穩定性試驗結果

2.3.2 高濕穩定性試驗結果

將芋螺毒素Lt14a樣品在正常溫度下，分別放置于濕度為75%和90%的環境中5 d和10 d之后，觀測其外觀形狀依然保持為白色結晶性粉末，無明顯變化。稱重后發現，重量略有升高。HPLC檢測含量后發現，樣品含量基本無變化，均大于98%。

表3 芋螺毒素Lt14a的高濕穩定性試驗結果

3 結 論

經過以上穩定性試驗研究，化學合成的芋螺毒素Lt14a樣品在酸性和光照環境下穩定性較好；同時應該避免暴露于堿性和氧化環境下；高溫或高濕的環境對Lt14a樣品基本無影響。因此，通過化學合成獲得的Lt14a樣品的穩定性能夠滿足臨床前研究的樣品需要。