加工番茄新番72號再生體系的建立

張西英 劉江娜 張愛萍

摘? ? 要：為建立一套優化的組織培養和遺傳轉化再生體系，以加工番茄新品種新番72號為試材，分別選取4～8 d苗齡無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，研究了不同苗齡、外植體、激素濃度配比對番茄愈傷組織誘導、不定芽分化的影響，以建立番茄再生體系，為下一步基于CRISPR-Cas9定點突變改良新疆加工番茄耐貯性奠定基礎。結果表明，新番72號加工番茄再生體系建立中以苗齡6 d的子葉為最佳外植體，愈傷誘導、芽分化率及生長情況均優于下胚軸;愈傷誘導最佳培養基為MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT，子葉的誘導率為90.5%，下胚軸的誘導率為80.8%;繼代培養芽分化的最佳培養基為MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT，子葉的芽分化率較高，可以達到85.3%。

關鍵詞：番茄;耐貯;子葉;再生體系

Abstract： To establish a set of optimal tissue culture and genetic transformation regeneration system， Xinfan 72 was used as material in this research， the cotyledon and hypocotyl of 4-8 days of aseptic seedlings were selected as explants， the effects of different seedling ages， explants and hormone concentrations on callus induction and adventitious bud differentiation in tomato were studied， in order to establish tomato regeneration system， lay the foundation for the next preliminary research on improving the storage tolerance of Xinjiang processed tomato based on CRISPR-Cas9 site-directed mutation. The results showed that cotyledons of 6d seedling age were the best explants in the regeneration system of Xinfan 72 tomato， and the callus induction， bud differentiation and growth were better than hypocotyl. The optimal callus induction medium was MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT， and the induction rate of cotyledons and hypocotyls were 90.5% and 80.8%， respectively. The best medium for bud differentiation in the secondary culture was MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT.

Key words： Tomato; Storage-resistant; Cotyledons; Regeneration system

番茄（Lycopersium esculentum Mill.）是一種重要的經濟作物和模式植物。近年來，研究人員已經利用組織培養技術培育出大量組培番茄[1-7]，并將其廣泛應用于番茄基因工程相關研究，自農桿菌介導番茄葉盤轉化法以來，番茄作為轉基因受體植物的研究得到迅速發展。雖然番茄的再生體系研究較多，但是不同基因型番茄的再生條件有很大的差異[8-15]，并且加工番茄與鮮食番茄之間及不同的加工番茄品種之間存在著不同的再生轉化體系[12]。

新番72號屬加工番茄早熟品種，田間綜合抗性較強，適宜新疆各地種植[16]，目前對其再生體系的研究還未見報道，因此研究其組培再生體系的建立，為利用此品種進行相關基因遺傳轉化等研究提供理論依據和技術支持，具有一定的應用價值。筆者以新番72號番茄為試材，分別選取無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，分析不同苗齡、不同激素配比對新番72號番茄愈傷誘導、不定芽分化的影響，篩選出最佳外植體和激素濃度組合，以期建立一套優化的新番72號番茄組織培養再生體系，為完善加工番茄再生體系研究及相關各領域研究提供一定的參考與理論依據，并為進一步基于CRISPR-Cas9定點突變改良新疆加工番茄耐貯性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄品種為新番72號，由新疆第六師農業科學研究所番茄課題組選育。母本A-10 是從里格爾87-5中篩選出綜合抗性好的株系，經過8代自交提純得到的穩定材料，屬早熟加工番茄品種;父本MG-01是從國外引進的加工番茄材料JQ-23，經7代分離、純化得到的穩定、早熟品系。

1.2 培養基

種子萌發培養基：1/2MS培養基（1/2MS大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+MS有機物質，不加蔗糖，0.7%瓊脂，pH 5.8～6.0）。

預培養基： MS（大量元素+MS 微量元素+MS 鐵鹽+MS有機物質+ZT 2 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1瓊脂粉，pH值5.8。

愈傷誘導培養基：MS（大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+MS有機物質;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1瓊脂粉+不同濃度的ZT、IAA、6-BA，pH值5. 8。

芽分化培養基 MS（大量元素+MS 微量元素+MS鐵鹽+MS有機物質;蔗糖 30 g·L-1）+5 g·L-1瓊脂粉+不同濃度的ZT、IAA、6-BA，pH值5.8。

1.3 方法

1.3.1 無菌苗的培養 選取籽粒飽滿、大小均一的番茄種子0.6 g，在超凈工作臺內加入50 mL 75%的乙醇，滅菌30 s，期間不斷晃動，將乙醇倒出，用無菌水沖洗2遍，然后加入27 mL的無菌水和3 mL的漂白劑，放到搖床上搖1 h 10 min，搖好后將液體倒出，用無菌水沖洗5遍，稍微留一點水，放到4 ℃冰箱過夜;將滅菌后的種子從冰箱里拿出來，播種到1/2 MS培養基中，每瓶接種50～60粒種子，接種完后直接放到組培室或人工氣候箱里培養，溫度設置為25～28 ℃、光照度1800 lx、光照處理16 h、黑暗處理8 h，4～8 d后獲得無菌苗。

1.3.2 苗齡試驗 試驗選取苗齡為4、6和8 d的番茄子葉或下胚軸作外植體，剪取子葉和下胚軸進行培養，接種于MS+IAA 0.1 mg·L-1+ZT 2.0 mg·L-1培養基中，培養20 d左右，在外植體基部的切口或傷口處形成愈傷組織和不定芽，觀察外植體的愈傷生長及芽分化情況，確定最適宜的番茄無菌苗苗齡。每個處理接種20個外植體，3次重復。

1.3.3 愈傷誘導及芽分化 試驗選取苗齡為6 d的番茄子葉或下胚軸作外植體，剪取子葉和下胚軸進行培養，接種于不同激素濃度的愈傷誘導和芽分化培養基中，觀察統計外植體的愈傷生長及芽分化情況。每個處理接種40個外植體，3次重復

1.3.4 數據處理 愈傷誘導率/%=產生愈傷的外植體數/接種的外植體數×100;芽分化率/%=產生芽的外植體數/接種的外植體數×100。數據采用Excel 2007處理，取3次重復的平均值±SD。

2 結果與分析

2.1 苗齡對番茄愈傷組織及不定芽誘導的影響

對不同苗齡番茄的子葉與下胚軸進行愈傷組織誘導，分析不同苗齡與外植體愈傷誘導率之間的關系。由表1可知，4 d苗齡的子葉還未完全展開，50%以上的外植體褐化，形成的愈傷組織黃化，后期芽分化率較低，原因可能是較低苗齡的子葉自身的修復能力弱，影響了細胞全能性;6 d苗齡子葉和下胚軸的愈傷出現時間早，其中80%以上的子葉出現愈傷，愈傷誘導率和分化率都較高;8 d以上苗齡有其他子葉長出，葉片老化，外植體再生誘導時愈傷組織后期易出現褐化現象。苗齡為6 d的子葉和下胚軸外植體所形成的愈傷組織呈淡綠色或綠色，生長速度快，分化能力較強，所以新番72號番茄再生體系建立中以苗齡6 d的子葉為最佳。

2.2 不同激素濃度配比對愈傷組織和芽分化誘導的影響

由表2～3可知，在不同激素組合的培養基上均能不同程度地誘導出愈傷組織，但誘導率和芽分化率存在一定差異，在同等濃度的激素下子葉和下胚軸的誘導率差異不大，但在繼代分化培養中，子葉芽分化率明顯高于下胚軸，下胚軸誘導出的愈傷后期分化出芽較少，有的會分化出葉片，但沒有中心生長點，不能形成完整帶芽植株;在加有6-BA的培養基中子葉和下胚軸的誘導率和分化率稍高一些，但6-BA濃度不能太高，否則會影響愈傷的誘導和分化。其中在最適激素濃度的培養基上誘導出的愈傷組織結構致密，體積大，生長速度快，將愈傷組織轉入分化培養基上繼續培養，部分愈傷組織可分化出不定芽，其中激素質量濃度為MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT愈傷組織誘導率最高，其子葉的誘導率為90.5%，下胚軸的誘導率為80.8%;在繼代培養中20～30 d后愈傷組織開始分化出現小芽或叢生芽，激素質量濃度為MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT子葉和下胚軸的愈傷組織產生的芽分化率較高，可以達到85.3%，在此培養基中不定芽生長健壯、數目較多，每個外植體平均再生芽數達到2.8個（圖1～3）。

3 討論與結論

理論上植物的組織和器官都可以作為建立再生系體和基因轉化的外植體，但不同植物間、同種植物不同品種間、同一品種植物不同組織器官間，在脫分化能力、再分化能力、細胞全能性潛在趨勢及感受態程度等方面都有很大差別，因此不同類型外植體對離體培養的反應是不同的，培養效果不同，分析原因可能主要與基因型有關，不同品種基因型不同，外植體再生能力也不同，因此有必要選擇再生培養效果最好的外植體，以利于進行后續工作。

在新番72號番茄再生體系建立中，苗齡6 d的子葉為最佳，這與前人[12-13，18-19]的研究結果不同，可能與番茄不同品種基因型、無菌苗的培養環境不同有關，從而延長或縮短了再生培養中最佳苗齡時間的選擇，因此，選擇適宜苗齡的無菌苗外植體是提高再生出芽率的關鍵。誘導新番72號愈傷的最佳培養基是MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 ZT，繼代培養芽分化的最佳培養基為MS+0.2 mg·L-1 IAA+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ZT，同時研究結果表明子葉誘導愈傷組織及芽分化能力優于下胚軸，這與文獻[8，11，13]的結果一致，與歐陽波等[7]的研究則相反，造成這種差異的原因：一是幼苗不同部位外植體內源激素濃度不同，對同一培養基表現出不同的敏感性;二是不同部位外植體間酶活性不同。同時已有研究表明基因型是影響番茄組織培養再生體系建立的重要因素[17-20]，因此針對不同品種的加工番茄，探索激素的最佳配比，篩選出分化率高的基因型和外植體材料作為培養對象，對于優化番茄再生體系是非常重要的。

筆者建立了加工番茄新番72號的組培再生體系，為其他品種再生體系的建立提供了一定的理論依據，同時為利用此品種進行番茄遺傳轉化等基因工程研究奠定了基礎。

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