shRNA靶向血管生成素2基因沉默聯合奧沙利鉑對子宮內膜癌生長抑制作用的研究

周凌，孫慧婷，楊思慧，荊秀娟，周懷君

(1.南京醫科大學 鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210008；2.常州市第二人民醫院 生殖中心，江蘇 常州 213003；3.南京中醫藥大學 中西醫結合鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210008；4.南京醫科大學鼓樓臨床醫學院 婦產科,江蘇 南京 210008)

子宮內膜癌(endometrial cancer,EC)是最常見的婦科癌癥，也是世界四大女性癌癥之一。2020年估計美國有65 620名婦女被診斷為EC，約有12 590名婦女將死于這種疾病[1]。據2015年國家癌癥中心統計，我國EC發病率為33/10萬，死亡率為22/10萬[2]。盡管子宮內膜樣腫瘤預后良好，但高達20%的患者會復發。對于漿液性腫瘤，約50%的患者病情惡化或不能通過一線治療治愈[3]。目前EC的治療原則以手術為主，輔以放療、化療、內分泌治療及生物治療等。內分泌治療和化療是晚期、復發或轉移性EC患者最主要治療手段，然而其有效率較低，患者的中位生存時間仍短于1年[4]。治療失敗的原因就是耐藥，耐藥的產生來自兩方面的因素：內因是各種形式的腫瘤異質性，癌癥基因組不穩定性；外因則是藥物的選擇壓力[5]。目前還做不到個體化的精準治療，合適的綜合性治療也能使癌癥患者生存獲益，如藥物的聯合應用，但是盲目地將不同的治療方法相疊加并不一定能得到1+1>2的效果[6]。近年來，化療+免疫檢查點抑制劑(immunecheckpoint inhibitor，ICI)+抗血管生成治療為腫瘤微環境的重塑提供了新的方向。這種協同作用 在對IMpower 150 的研究中得到了印證，化療+抗血管生成治療+ICI 方案可使肝轉移的晚期非鱗狀非小細胞肺癌患者的生存期顯著延長[7]。但是ICI所顯示出的較強毒副作用使其使用受到限制。而化療聯合抗血管生成治療因其毒副作用較小又能延長生存期，所以在各種晚期和復發性惡性腫瘤治療中得到廣泛使用。化療聯合抗血管生成治療的效果強弱與藥物的選擇及給藥手段密切相關。

鉑類藥物作為一類經典的抗癌藥物，在臨床化療上具有舉足輕重的地位，也是治療EC常用的藥物，經過一代順鉑、二代卡鉑的改良研制出以奧沙利鉑為代表的三代鉑類藥物。奧沙利鉑通過與核DNA形成交叉聯結干擾DNA 復制和轉錄系統而發揮抗癌活性[8]。與其他鉑化合物相比奧沙利鉑因耐受性更好、毒副作用更小而得到廣泛應用，但它仍然存在一些毒副作用，如神經毒性、血液和胃腸道毒性、中性粒細胞減少、惡心和嘔吐等，這些無疑限制了其可用劑量范圍[9]。目前，采用聯合用藥對抗化療藥物的毒性及耐藥性是一種較好的方法。我們的前期實驗證實，奧沙利鉑具有抑制EC裸鼠移植瘤生長的作用，又能抑制腫瘤組織中血管生成素2(angiopoietin 2，Ang2)的表達[10]。這提示我們奧沙利鉑與抗Ang2聯合應用可能對抗EC起到協同作用。Ang/Tie 軸是介導血管重塑和新生血管成熟過程的信號通路[11]。生理狀態下，血管旁支持細胞如周細胞、血管平滑肌細胞分泌的Ang1可與Tie2結合，從而調節內皮細胞之間、內皮細胞與血管外膜細胞之間的相互作用，促進血管成熟，并維持血管正常的有序結構。但腫瘤細胞分泌Ang2，它可與Ang1 競爭性結合Tie2，而Ang2與Tie2 的結合并不能引起后續信號通路的正常激活[12-14]，因此，腫瘤新生血管具有結構排列紊亂、血管壁不完整、血管壁不連續的特點[15]，從而進一步加重局部乏氧狀態，并嚴重影響抗腫瘤藥物的投遞。腫瘤內部處于高酸、低氧微環境，異常的血管結構也為腫瘤細胞的侵襲和轉移提供了途徑。靶向Ang/Tie 軸的藥物能夠促進腫瘤血管正常化，在防止腫瘤轉移的同時能夠與化療藥物或ICI聯合使用，增強藥物的遞送效率。促進腫瘤血管正常化的抗血管生成療法與其他療法的聯合是治療腫瘤的新策略[12]。

RNA干擾，特別是小干擾RNA(siRNA)，提供了一種沉默特定基因來控制腫瘤血管生長的替代方法。雖然siRNA治療在體內降解快、內化差，但納米顆粒可以作為其無毒、高效的傳遞載體，甚至可以引入多種治療藥物的聯合傳遞[16-18]。本實驗小組采用shRNA靶向 Ang2/Tie2 軸的抗血管生成療法促進腫瘤血管的正常化，研究shRNA靶向Ang2基因沉默聯合奧沙利鉑對子宮內膜癌EC生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和奧沙利鉑使用劑量

人類EC Ishikawa細胞由北京大學人民醫院魏麗慧教授提供。細胞在加入10%胎牛血清和100 U·ml-1青霉素及100 U·ml-1鏈霉素的DMEM 培養基[(賽默飛世爾科技(中國)有限公司]中培養。奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號:09111511)。使用奧沙利鉑處理細胞時,奧沙利鉑在細胞培養液中終濃度為10 mg·ml-1，細胞在37 ℃、5%CO2的環境中培養24 h或48 h[19]。

1.2 實驗分組

體外細胞和在體動物實驗均隨機分為5組，分別為生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組。其中生理鹽水組、奧沙利鉑組的干預因素是生理鹽水，規避奧沙利鉑溶劑帶來的干擾；空載質粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組干預因素是PBS和質粒，設立空載質粒組規避PBS和質粒給實驗組帶來的干擾；Ang2敲低聯合奧沙利鉑組既有Ang2的敲低又有奧沙利鉑雙重因素的干預。

1.3 Ang2 shRNA設計和構建質粒穩轉細胞系

由Genepharma(上海吉瑪制藥技術有限公司)設計Ang2特異性shRNA，并合成攜帶Ang2 shRNA的pRNAT-CMV3.2-Neo及陰性對照pRNAT-CMV3.2-Neo-neg質粒。在6孔細胞培養板中接種293T細胞，在細胞融合度達50%時進行轉染。使用Opti-MEM稀釋lipofectamineTM3000(美國賽默飛世爾科技公司)，同時使用Opti-MEM稀釋P3000TM，并將Ang2-shRNA的pRNAT-CMV3.2-Neo質粒、PSPXA2質粒及PMD2G質粒按照4∶3∶1的比例混勻加入稀釋好的P3000TM中，按照同樣方法將陰性對照pRNAT-CMV3.2-Neo-neg質粒與PSPXA2質粒及PMD2G質粒混勻后加入稀釋好的P3000TM中。將稀釋后的lipofectamineTM3000分別與上述混合物共同孵育15 min，加入293T細胞中，37 ℃培養24、48 h后收取細胞上清作為病毒液，將收取的病毒液加入融合度達30%的Ishikawa細胞中，37 ℃培養72 h后加入嘌呤霉素篩選穩轉成功的Ishikawa細胞。

1.4 qRT-PCR分析Ang2 mRNA表達

使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)制備細胞總RNA，用HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將總RNA逆轉錄成cDNA。將SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、cDNA和引物按比例混勻。使用QuantStudio 6 Flex(美國應用生物系統公司)進行檢測。將GAPDH管家基因作為內參基因，消除因提取的cDNA濃度不同產生的差異。Ang2正向引物5′-AACATCCCAGTCCACCTGAG-3 ′，反向引物5′-GGTCTTGCTTTGGTCCGTTA-3′；GAPDH正向引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，反向引物5′-ACCAGAGTTAAAAGCCCCTG-3′。cDNA按照按試劑盒說明書進行擴增，PCR循環條件為95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個反應循環；溶解曲線95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每組設置3個復孔，每項實驗重復3次。

1.5 蛋白質印跡法檢測Ang2蛋白相對含量

收集細胞或組織，使用RIPA(上海碧云天生物技術有限公司)裂解細胞或組織。按比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)，沸水浴10 min使蛋白充分變性。將處理好的蛋白樣品加入配好的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠孔內，電泳30 mV 20 min、50 mV 60 min，轉膜250 mV 120 min。將PMDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。用鼠標單克隆抗體Ang2(MM0020-1F29,ab56301)[艾博抗(上海)貿易有限公司]和鼠標單克隆抗體GAPDH分別在4 ℃過夜孵育。用抗鼠辣根peroxidase-conjugated二抗[艾博抗(上海)貿易有限公司]室溫孵育2 h。最后涂勻Immobilon Western 曝光液(美國默克密理博公司)，并用Tanon全自動化學發光圖像分析系統進行顯影。通過ImageJ對數字化自動圖像進行密度分析。

1.6 Ishikawa細胞凋亡實驗

將各組細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細胞兩次，收集5×105個細胞，使用annexin V-PE凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)行凋亡檢測，用Buffer輕柔垂懸細胞，加入1 μl annexin V-PE進行染色，室溫避光孵育15 min。采用流式細胞儀(FACSCalibur,Becton Dickinson)檢測凋亡水平，并使用BD FACSDiva軟件對結果進行分析。實驗重復3次。

1.7 Ishikawa細胞侵襲實驗

用基質膠[碧迪醫療器械(上海)有限公司] 1∶10包被24孔板的小室(corning，America)底部，放置于37 ℃培養箱中1 h使膠凝固。將Ishikawa細胞用無血清培養基垂懸，按1×105個細胞·孔-1轉移上室中。將含10%胎牛血清的DMEM加入下室作為趨化因子誘導細胞運動。培養48 h后用棉簽輕輕擦去小室上層表面的細胞，在下室加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.5%結晶紫染色。在放大200倍的倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數。實驗重復3次。

1.8 動物實驗

本研究經南京大學附屬南京鼓樓醫院倫理委員會批準。40只4周齡雌性BALB/c裸小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)經南京鼓樓醫院動物護理與使用委員會批準使用，圈養在專門的SPF設施中。小鼠隨機分為生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質粒組、Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組，每組8只。用PBS按照1×107個細胞、0.2 ml·小鼠-1，用30 G針頭和1 ml注射器在動物背部皮下注射相應細胞，每天觀察。當腫瘤生長14 d時，生理鹽水組給予等同治療組劑量的生理鹽水腹腔注射，奧沙利鉑和Ang2敲低聯合奧沙利鉑治療組給予奧沙利鉑(根據人小鼠體表面積換算方法，0.25 mg·m-2) 腹腔注射[20-21]，每周注射1次，連續5次。每兩天測量1次腫瘤體積(體積=長×寬×寬×0.52)，觀察腫瘤生長情況。所有小鼠在首次注射后第28天處死。收集裸鼠，選擇各組裸鼠代表拍照，然后將腫瘤剖出拍照，測量腫瘤體積，計算抑瘤率[抑瘤率=(對照組平均體積-實驗組平均體積)/對照組平均體積×100%]，抑瘤率≥40%并經統計學處理P<0.05為有效。然后將一半腫瘤組織立即放入液氮中進行RT-PCR和蛋白質印跡法檢測 Ang2的表達情況；另一半放入4%多聚甲醛中進行免疫組織化學檢測，分析腫瘤血管分布情況。

1.9 裸鼠移植瘤組織微血管密度檢測

采用免疫組織化學方法檢測移植瘤組織vWF蛋白來標記腫瘤血管。制作腫瘤組織石蠟切片并作常規處理至抗原修復，5% BSA 封閉20 min，vWF、一抗 [艾博抗(上海)貿易有限公司] 4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次后滴加生物素標記的二抗(江蘇盈科生物制藥有限公司)，37 ℃ 孵育30 min后DAB試劑(江蘇盈科生物制藥有限公司)顯色，蘇木素復染后封片。針對vWF抗體染色行微血管密度(MVD) 計數，先在低倍鏡下(40倍和100倍)掃描切片，選擇2～3個染色密度較高的區域作為“熱點”區域，然后使用尼康E-400顯微鏡在200倍鏡下計數視野內被染色的血管數。MVD定義為每高倍鏡下的血管數(HPF，×200)，取8個腫瘤標本的平均值[22]。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 各組Ishikawa細胞中Ang2 mRNA和蛋白的表達情況

a P<0.05；b P<0.001；c P>0.05A.RT-PCR檢測結果；B.蛋白質印跡法檢測結果圖1 各組Ishikawa細胞中Ang2 mRNA和蛋白的表達情況

Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組相比，Ang2 mRNA含量分別降低了76.54%、80.24%(均P<0.001)，Ang2蛋白表達量分別降低60.79%、65.09%(均P<0.001)；奧沙利鉑組與生理鹽水組比較，Ang2 mRNA和蛋白表達量分別降低了21.8%和22.9%(均P<0.05)；Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與奧沙利鉑組比較，Ang2 mRNA和蛋白表達量均降低(均P<0.001)，但與Ang2敲低組比較無明顯降低(P>0.05)。

2.2 各組Ishikawa細胞凋亡率和侵襲數量檢測

各組Ishikawa細胞凋亡率分別為：生理鹽水組(8.56±1.23)%，空載質粒組(7.90±2.32)%，奧沙利鉑組(52.13±4.14)%，Ang2敲低組(35.93±4.96)%，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組(61.55±5.03)%。奧沙利鉑組與生理鹽水組比較細胞凋亡率明顯增加(P<0.001)；Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組比較細胞凋亡率顯著增加(均P<0.001)；Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與Ang2敲低組比較細胞凋亡率明顯增加(P<0.001)，與奧沙利鉑組比較細胞凋亡率有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2A。

a P<0.001圖2 各組Ishikawa細胞凋亡率和侵襲數量檢測結果

各組細胞遷移數分別為：生理鹽水組80.56±4.28，空載質粒組77.90±2.32，奧沙利鉑組20.13±4.16，Ang2敲低組38.93±4.86，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組12.55±4.96。奧沙利鉑組與生理鹽水組比較細胞遷移數明顯減少(P<0.001)；Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組比較細胞遷移數顯著減少(均P<0.001)；Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與Ang2敲低組比較細胞遷移數明顯減少(P<0.001)，與奧沙利鉑組比較細胞遷移數差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2B。

2.3 各組裸鼠皮下移植瘤在體生長情況和離體狀態下腫瘤體積及抑瘤率

裸鼠背部植入不同處理的Ishikawa細胞第7天生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質粒組可見腫瘤出現，Ang2敲低組在第14天可見腫瘤出現，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組在第21天可見腫瘤出現。腫瘤植入成功率100%。在第21天時生理鹽水組、奧沙利鉑組、空載質粒組瘤體直徑約10 mm，Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組瘤體直徑約4 mm和2 mm。各組處理28 d后腫瘤生長情況見圖3。各組移植瘤體積和抑瘤率見表1。Ang2敲低聯合奧沙利鉑組、Ang2敲低組、奧沙利鉑組與生理鹽水組相比腫瘤體積顯著減小，差異具有統計學意義(均P<0.001)；Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與奧沙利鉑組及Ang2敲低組相比腫瘤體積顯著減小，差異具有統計學意義(均P<0.001)。Ang2敲低聯合奧沙利鉑組、Ang2敲低組、奧沙利鉑組抑瘤率均大于40%，符合抑瘤率有效的判斷標準。

a P<0.001A.每組的裸鼠代表；B.與 A圖裸鼠相對應的解剖瘤體積；C.各組腫瘤體積比較圖3 各組裸鼠皮下移植瘤生長情況

表1 各組裸鼠皮下移植瘤體積及抑瘤率

2.4 各組移植瘤內Ang2的表達和MVD

Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組比較Ang2 mRNA的表達顯著降低(均P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較Ang2 mRNA的表達明顯降低(P<0.05)，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較Ang2 mRNA表達也顯著降低(均P<0.001)，見圖4A。Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組比較Ang2 蛋白表達顯著降低(P<0.05或P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較Ang2 蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較Ang2 蛋白表達也顯著降低(均P<0.001)，見圖4B。Ang2敲低組、Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與空載質粒組比較MVD明顯降低(均P<0.001)，奧沙利鉑組與生理鹽水組比較MVD明顯降低(P<0.001)，Ang2敲低聯合奧沙利鉑組與Ang2敲低組、奧沙利鉑組比較MVD顯著降低(P<0.05或P<0.001)，見圖4C、表2。

表2 各組移植瘤組織中 HPF·高倍鏡-1

3 討 論

由于惡性腫瘤發生機制復雜多樣、腫瘤的異質性和進化特性，個性化的精準治療很難實現。目前抗癌的策略無非兩個方面：一是采取各種手段殺傷癌細胞；二是破壞癌細胞的生存環境。上述兩方面的聯合療法是醫學工作者的共識。化療聯合抗血管生成是當前臨床上最常用療法。在本實驗中我們選擇奧沙利鉑和Ang2 shRNA對抗Ishikawa細胞活性，這種方法有兩方面的優勢,一是奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯合具有抗腫瘤的協同作用，二是減弱了耐藥性和毒副作用。

a P<0.05；b P<0.001A.各組移植瘤組織Ang2 mRNA含量；B.各組移植瘤中Ang2蛋白表達情況；C.各組MVD的比較圖4 各組移植瘤組織中Ang2 mRNA和蛋白表達情況及MVD

奧沙利鉑對人腫瘤細胞系，特別是順鉑耐藥細胞系具有有效的抗腫瘤活性。臨床前研究也提示奧沙利鉑脂質體制劑具有顯著的抗血管生成活性[23]。在我們的實驗中也證明了這一點：應用小劑量奧沙利鉑治療后，奧沙利鉑組和Ang2敲低聯合奧沙利鉑組 中 Ang2無論在細胞水平還是在Ishikawa異種移植物腫瘤組織中的表達都顯著降低，特別是聯合治療組Ang2的表達更低，而且新生血管密度也明顯低于奧沙利鉑組、空載質粒組和Ang2敲低組。Liu等[24]也發現低劑量奧沙利鉑對H22肝癌荷瘤小鼠血管內皮生長因子(VEGF)和MVD的表達有明顯的抑制作用，認為低劑量奧沙利鉑在體內可能對腫瘤組織的血管生成有抑制作用。這說明此種聯合既能抑制Ang2又能抑制VEGF的可能性。然而，上述研究結果與Fan等[25]的研究結果相矛盾，他們發現奧沙利鉑在結腸癌細胞中誘導了VEGF家族的幾個成員表達增加，包括VEGF-a、VEGF-c和PIGF。該研究未涉及在體動物實驗，在體情況下能否誘導VEGF-a、VEGF-c和PlGF不太清楚，另外不同腫瘤細胞的特異性也可能會導致這種結果的出現。奧沙利鉑對不同腫瘤細胞除了發揮細胞毒性之外還有不同的作用。奧沙利鉑是否在EC細胞中對VEGF家族的幾個成員有作用，還需要進一步的研究證實。本研究結果顯示，奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯合具有抗血管生成的協同作用。

面對癌癥的進化，人們一再看到新藥的有效性，隨之而來的是腫瘤耐藥，目前用于EC的抗血管生成最常用的為VEGF/VEGFR2抑制劑，但是并非所有患者都對該抑制劑有反應，有些患者在長期使用后還是出現了耐藥性[26]。于是，通過恢復腫瘤的血液灌注和氧氣供應以使腫瘤血管正常化的學說被提出，并開始了第二代抗血管生成劑的研發，即靶向Ang/Tie 軸的藥物[27]。基于上述學說，本實驗采用奧沙利鉑與Ang2 shRNA聯合的治療方法，一方面抑制血管的生成，另一方面使血管正常化，增加奧沙利鉑的利用效率。所以聯合治療組裸鼠移植瘤生長速度非常緩慢，大大提高了抑瘤率。

另一方面，我們采用siRNA靶向Ang2的新型治療手段，siRNA幾乎沒有毒副作用，故不產生耐藥性[28]。所以siRNA在癌癥研究領域得到了前所未有的應用。許多研究已經使用siRNAs靶向與癌癥的起始和生長相關的基因，并表明該技術可能是在動物模型中治療癌癥的有效手段。在最近的報道中，siRNA被用來靶向胃癌細胞中的sphingosine kinase1(SphK1)、cyclin D1、survivin基因、HER-2/neu受體以及VEGF基因[29-33]。在這些研究中，siRNA的使用已經在體內有效地抑制了腫瘤的生長，并可能成為一種新的抗血管生成治療方法。靶向VEGF siRNA是第一個在人類臨床試驗中用于治療年齡相關性黃斑變性的例子。在小鼠身上的臨床前研究顯示，siRNA直接注射后，VEGF表達下調，新生血管生成減少[34]。我們的實驗也獲得了與之一致的結果。

我們在體外細胞實驗中發現，Ang2 shRNA可以促進Ishikawa細胞的凋亡、抑制細胞侵襲能力，這也是移植瘤生長緩慢的一個重要原因。此結果提示Ang2可能通過某些途徑影響了Ishikawa細胞的生物學行為，這需要以后進行深入的機制研究。

總之，本實驗通過體外實驗證明了奧沙利鉑聯合Ang2 shRNA能有效地抑制EC細胞Ang2的表達。奧沙利鉑聯合Ang2 shRNA與單純奧沙利鉑療法相比對Ishikawa細胞的凋亡有更好的促進作用，對細胞的侵襲能力有更明顯的抑制作用。動物模型研究進一步證明了降低Ang2的表達可增強小劑量奧沙利鉑對小鼠移植瘤模型腫瘤生長和血管生成的抑制作用，是一種有希望的、新穎的、安全的、能提高化療效果的治療措施。這是一初步的研究結果，還須進一步進行作用機制的探討及治療效應標志物的檢測。