lncRNA LINC00339靶向miR-520a-3p對卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響

李倩，劉丹彤，姚海榮，齊冰麗

(滄州市中心醫院 婦產科，河北 滄州 061000)

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌和子宮癌，患者生存預后較差[1]。目前臨床上主要采用手術結合放療和化療等綜合方案治療卵巢癌，但是治療效果不令人滿意。深入分析卵巢癌的發病機制，并開發出新的治療靶點有重要意義[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸且不編碼蛋白質的RNA，廣泛存在于真核細胞轉錄組中，在表觀遺傳學調控中發揮重要作用[2]。既往研究證實，lncRNA在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移和細胞周期的調控中起到重要作用。近年來，lncRNA在卵巢癌診斷和治療中的作用引起了廣泛重視[3]。LINC00339是新發現的一種lncRNA，在乳腺癌、胃癌、肝細胞癌和膠質瘤中表達水平升高[4-7]。LINC00339在卵巢癌中的作用及其機制既往少有報道。miR-520a-3p在腫瘤中可能發揮抑癌基因作用[8-9]。本課題組前期用Target Scan軟件預測到微小RNA(microRNA，miRNA)-520a-3p可能是LINC00339的靶基因。本研究分析LINC00339對miR-520a-3p的靶向調控作用，并分析其對卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響，旨在闡明LINC00339在卵巢癌中的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

卵巢癌細胞系(SKOV3、A2780、OVCAR3、HO-8910)和正常卵巢上皮細胞系(HOSEpiC)均購于中國科學院上海細胞庫。胎牛血清和RPMI-1640培養基購于廣州碩恒生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑購于美國Sigma公司；sh-LINC00339、anti-miR-520a-3p、miR-520a-3p mimics、pcDNA3.1-LINC00339及其對照質粒均購于美國Invitrogen公司；引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒、Transwell小室、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠快速制備試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購于英國Abcam公司；反轉錄試劑盒、2倍稀釋的SYBR綠色熒光染料實時PCR試劑盒購于上海聯邁生物工程有限公司。

1.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測細胞中LINC00339和miR-520a-3p的相對表達水平

用TRIzol法提取細胞中總RNA，用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，反應體系為2 μl 5倍稀釋的反應混合液、1 μl RNA和7 μl H2O，條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。隨后用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒，以cDNA為模板進行PCR，反應體系為10 μl SYBR、1 μl cDNA、1 μl引物和8 μl H2O，條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s(40個循環)，72 ℃ 10 min。用2-△△Ct法計算LINC00339和miR-520a-3p相對表達量。引物序列：LINC00339：上游5′-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3′，下游5′-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3′；miR-520a-3p：上游5′-CGAGAGGGCTGGTCCTT-3′，下游5′-GTCCCGAATGTGCTGAGTT-3′；GAPDH：上游5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。

1.3 沉默LINC00339對SKOV3細胞增殖和侵襲的影響

1.3.1 細胞培養和轉染 將細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中進行培養，培養環境為37 ℃、5%CO2。待細胞融合度達80%時進行傳代。轉染前24 h將SKOV3細胞接種于6孔培養板中，當細胞融合達40%時取sh-NC和sh-LINC00339，用血清培養基稀釋至100 nmol·L-1，每孔加入2 ml。隨后加入LipofectamineTM2000試劑進行轉染，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。轉染6 h后更換為完全RPMI-1640培養基，48 h后取對數生長期細胞進行后續檢測。

1.3.2 克隆形成實驗和MTT實驗檢測SKOV3細胞增殖活力 克隆形成實驗：收集對數生長期SKOV3細胞，用胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養細胞3周。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時停止培養，用4 %多聚甲醛進行固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞克隆數目。MTT實驗：收集對數生長期SKOV3細胞，接種于96孔板中，培養48 h后棄去培養基，加入MTT溶液，避光孵育4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜，在酶標儀(490 nm波長)上檢測光密度(OD)值，反映細胞增殖能力。

1.3.3 Transwell實驗檢測SKOV3細胞侵襲力 首先在Transwell板上室鋪基質膠(用無血清培養基將Matrigel基質膠稀釋8倍)，隨后將SKOV3細胞接種于Transwell小室；下室中加入細胞培養基。培養48 h后取出Transwell小室，用多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的SKOV3細胞，用結晶紫染色15 min，隨后用PBS洗滌3次，待干燥后在顯微鏡下取5個視野進行觀察，計算平均侵襲細胞數。

1.4 雙熒光素酶報告基因驗證LINC00339和miR-520a-3p的靶向作用關系

將LINC00339突變型熒光素酶報告載體(LINC00339-MUT)、野生型熒光素酶報告載體(LINC00339-WT)分別同miR-520a-3p模擬物、模擬陰性對照共轉染到細胞中，檢測熒光素酶活性。為了進一步驗證LINC00339與miR-520a-3p的靶向關系，向細胞中轉染相關質粒，步驟同1.3.1。將細胞分為：(1) 對照組(miR-NC組)、模擬物組(miR-520a-3p mimics組)、miR-520a-3p抑制組(anti-miR-520a-3p組)，檢測各組LINC00339相對表達水平(方法同1.2)；(2) 空載體組(pcDNA3.1組)、LINC00339過表達組(pcDNA3.1-LINC00339組)、陰性對照組(sh-NC組)、LINC00339抑制組(sh-LINC00339組)，檢測各組miR-520a-3p相對表達水平(方法同1.2)。

1.5 LINC00339靶向miR-520a-3p對SKOV3細胞增殖和侵襲的影響

用質粒轉染SKOV3細胞，步驟同1.3.1。將SKOV3細胞分為對照組(sh-NC+miR-NC組)、LINC00339抑制組(sh-LINC00339+miR-NC組)、LINC00339抑制+miR-520a-3p抑制組(sh-LINC00339+anti-miR-520a-3p組),檢測各組細胞增殖(方法同1.3.2)和侵襲(方法同1.3.3)。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 LINC00339和miR-520a-3p在卵巢癌細胞中的表達

與HOSEpiC細胞比較，SKOV3、A2780、OVCAR3和HO-8910細胞中LINC00339相對表達量明顯升高(均P<0.001)，而miR-520a-3p相對表達量明顯降低(均P<0.001)，見圖1。

2.2 沉默LINC00339對SKOV3細胞增殖和侵襲和影響

與sh-NC組比較，sh-LINC00339組LINC00339相對表達量，克隆細胞數，轉染24、48、72h時細胞增殖活力和侵襲細胞數明顯降低(均P<0.05)，見圖2。

2.3 LINC00339靶向miR-520a-3p的鑒定

Target Scan軟件預測到LINC00339和miR-520a-3p有結合位點(圖3A)。miR-520a-3pmimics可以明顯抑制PGLO-LINC00339-WT的熒光素酶活性(P<0.001)，而anti-miR-520a-3p可以增強PGLO-LINC00339-WT活性(P<0.001，圖3B)。miR-520a-3pmimics可以下調LINC00339表達水平(P=0.018)，而anti-miR-520a-3p可以上調LINC00339表達水平(P<0.001，圖3C)。另外，pcDNA3.1-LINC00339可以下調miR-520a-3p相對表達量(P=0.001)，而sh-LINC00339可以上調miR-520a-3p相對表達量(P=0.031，圖3D)。以上結果說明LINC00339可以靶向作用于miR-520a-3p。

a與HOSEpiC細胞比較，P<0.05圖1 RT-PCR檢測卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞中LINC00339和miR-520a-3p的相對表達量

a 與sh-NC組比較，P<0.05A.RT-PCR檢測LINC00339相對表達量；B.克隆形成實驗檢測細胞增殖活力；C.MTT實驗檢測細胞增殖活力；D.Transwell實驗檢測細胞侵襲能力圖2 沉默LINC00339對SKOV3細胞增殖和侵襲和影響

a與miR-NC組比較，P<0.05；b與pcDNA3.1組比較，P<0.05；c與sh-NC組比較，P<0.05A.Target Scan軟件預測到LINC00339和miR-520a-3p有結合位點；B.各組熒光素酶活性；C.過表達或抑制miR-520a-3p對細胞LINC00339表達水平的影響；D.過表達或抑制LINC00339對細胞miR-520a-3p的影響圖3 LINC00339靶向miR-520a-3p的鑒定

2.4 LINC00339靶向miR-520a-3p對細胞增殖和侵襲的影響

共轉染sh-LINC00339和miRNA陰性對照質粒后，克隆細胞數，轉染24、48、72 h時細胞增殖活力和侵襲細胞數明顯降低(均P<0.05)，而共轉染sh-LINC00339和anti-miR-520a-3p質粒可逆轉上述效應(均P<0.05)，見圖4。

3 討 論

卵巢癌的發病機制目前尚未完全明確，表觀遺傳學調控在卵巢癌中的作用越來越受到重視[10]。lncRNA是表觀遺傳調控分子，不但可以調節組蛋白和DNA的化學修飾，而且能夠調控表觀遺傳通路本身的基因，進而從根本上對基因組的表達產生影響[2,11]。lncRNA在卵巢癌發生和發展中起到重要作用，例如lncRNA ATB可以促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并且與患者不良生存預后有關[12]。lncRNA可能作為卵巢癌分子生物學標志物，在卵巢癌早期診斷和治療中發揮重要作用[13]。

LINC00339也被稱為HSPC157，基因位于chr1:22，024，558-22，031，224(GRCh38/hg38)和chr1:22，351，681-22，357，716(GRCh37/hg19)，主要表達于卵巢癌細胞的細胞質中[14]。與癌旁組織比較，卵巢癌組織中LINC00339表達水平較高[14]。本研究結果顯示，卵巢癌細胞系(SKOV3、A2780、OVCAR3、HO-8910)中LINC00339的相對表達量明顯高于正常卵巢上皮細胞系(HOSEpiC)，轉染LINC00339-siRNA后SKOV3細胞的增殖活力和侵襲能力明顯下降，提示LINC00339可能參與卵巢癌的發生和發展。

LINC00339在腫瘤中的作用機制目前尚未完全明確，lncRNA對miRNA的調節機制可能是其發揮作用的重要途徑。有研究發現，LINC00339可以抑制miR-377-3p，上調DCP1A表達，進而促進胃癌細胞的增殖和侵襲[5]。Wang等[15]也發現，LINC00339靶向調控miR-377-3p/HOXC6，促進三陰性乳腺癌細胞的增殖，并抑制凋亡。在膠質瘤中，LINC00339可以通過miR-539-5p/TWIST1/MMPs軸促進瘤組織血管新生[16]。LINC00339還能通過miR-145調控上皮間質轉換，促進食管鱗癌的進展[17]。

a 與sh-NC+miR-NC組比較，P<0.05；b 與sh-LINC00339+miR-NC組比較，P<0.05A.克隆形成實驗檢測細胞增殖；B.MTT實驗檢測細胞增殖；C.Transwell實驗檢測細胞侵襲能力圖4 LINC00339靶向miR-520a-3p對細胞增殖和侵襲的影響

miR-520a-3p在腫瘤中低表達，可能作為抑癌基因而發揮作用[18]。有研究發現，miR-520a-3p可能通過EGFR信號通路[19]、JAK/STAT信號通路[9]和PI3K/AKT/mTOR信號通路[20]等抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉換。本課題組前期用Target Scan軟件預測到miR-520a-3p可能是LINC00339的靶基因，本研究中我們用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。本研究發現，共轉染sh-LINC00339和miRNA陰性對照質粒后，克隆細胞數，轉染24、48、72 h時細胞增殖活力和侵襲細胞數明顯下降，而共轉染sh-LINC00339和anti-miR-520a-3p質粒可逆轉上述效應。結果提示，LINC00339可能通過靶向作用于miR-520a-3p促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲。

本研究存在以下局限性：(1) 并未檢測增殖和侵襲相關蛋白指標的變化；(2) 未直接分析miR-520a-3p下游分子信號通路的變化；(3) 未分析LINC00339與卵巢癌臨床病理特征及生存預后的關系。

綜上所述，LINC00339在卵巢癌細胞中高水平表達，可能通過靶向調控miR-520a-3p促進癌細胞的增殖和侵襲。LINC00339可能會成為卵巢癌的治療靶點，未來需要深入分析其潛在生物學機制，并且分析其臨床應用價值。