諾維氏梭菌對小鼠移植性肝癌的抑制作用*

黃筱鈞，鄧昭敏，王紅仁，鄺玉，李婉宜，李明遠

445000湖北 恩施，湖北民族大學醫學部 病原生物學教研室(黃筱鈞)；610041成都，西藏自治區人民政府駐成都辦事處醫院 醫學檢驗科(鄧昭敏)；610041成都，四川大學華西基礎醫學與法醫學院 微生物學教研室(王紅仁、鄺玉、李婉宜、李明遠)；610041成都，四川大學華西第二醫院 醫學檢驗科(李明遠)

2018年全球960萬人死于腫瘤，肝癌的死亡率位居第3位[1]。現有的治療方法都不能顯著延長肝癌患者的生存期，其5年生存率僅18%，探尋新的治療方法迫在眉睫[2]。促進肝癌發展，影響肝癌等實體瘤治療效果的最大因素是腫瘤局部微環境[3-4]，其中乏氧是肝癌微環境的重要特點。乏氧微環境是肝癌產生藥物抗性和化療抗性的主要原因，因此，破壞或利用乏氧微環境成為實體瘤治療的新策略。300多年前就有腫瘤患者感染后腫瘤自然消退的病例記載，但因為無法解釋其原理，用于治療時無法接受發熱等副反應，且治療過程無法標準化，導致細菌抗腫瘤研究一直沒有較大進展。隨著生物技術的發展，研究人員利用基因改造的方法去除厭氧菌的毒性基因，或將厭氧菌改造為抗腫瘤藥物的載體，從而克服厭氧菌自身的毒副作用和化療藥物選擇性差、瘤內濃度低的不足，有效利用腫瘤氧含量低、血供差的微環境[5]。厭氧菌抗腫瘤隨之引起了人們極大關注。

多項研究發現厭氧性細菌對實體瘤的乏氧區和壞死區具有選擇性定植的能力，表現出溶瘤效應。諾維氏梭菌(Clostridiumnovyi，C.novyi)為厭氧芽胞梭菌屬的成員，廣泛分布于外界環境中，可從土壤、海洋沉淀物、人類氣性壞疽傷口或動物的局部感染傷口中分離得到，熱休克法可以獲得無毒諾維氏梭菌(nontoxigenicClostridiumnovyi，C.novyi-NT)[6]。裸鼠研究結果顯示，C.novyi-NT對黑色素瘤、結腸癌、腎癌、軟組織肉瘤、胰腺癌、腦瘤及惡性膠質瘤均表現出抑制作用，I期臨床試驗證實C.novyi-NT對人體腫瘤也有抑制作用[7-11]。目前尚沒有單用C.novyi-NT抗免疫正常小鼠肝癌的報道。本研究選擇最常用、易操作、易觀察的方法建立BALB/c小鼠H22皮下移植瘤模型，采用瘤內注射C.novyi-NT方式進行干預，評估C.novyi-NT對小鼠移植性肝癌的抑瘤效應，及其在腫瘤和重要器官的定植情況，確定瘤內注射的最佳劑量，并觀察細菌干預后荷瘤鼠炎癥反應、抗腫瘤免疫及腫瘤轉移情況，為后續探索C.novyi-NT抗肝癌的機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 動物、細菌和細胞

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重(18±2)g，購自成都達碩實驗動物有限公司(許可證號：SCXK(川) 2013-24)。實驗動物所有操作取得了四川大學華西基礎醫學與法醫學院實驗動物倫理委員會批準(批號IACUC-20140010)。C.novyi為ATCC 19402株，熱休克法去毒[6]，獲得C.novyi-NT。肝癌H22細胞株由四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理學教研室保存。

1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂培養基(OXOID)、細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP302)、組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP304)、改良型RPMI-1640培養基(Hycone，NAD1385)，胎牛血清(Gibco，1551835)、2000bp DNA Marker(Takara，DL2000),2×Taq Master Mix(Novoprotein，E005)。

1.3 主要儀器

光學顯微鏡(Leica，DM750)、紫外分光光度計(K.O，K5600)、PCR儀(BIOER)、電泳儀(BIO-RAD)、凝膠成像系統(BIO-RAD)、厭氧罐(重慶艾奇醫療器械有限公司)。

1.4 主要方法

1.4.1 建立小鼠皮下移植瘤模型 收集BALB /c小鼠H22腹水，用生理鹽水洗滌、離心，收集沉淀細胞，稀釋為1.0×107/mL。無菌環境下，每只小鼠左前肢皮下注射0.2 mL H22細胞懸液。待腫瘤肉眼可見后每周2次用電子數顯卡尺測量腫瘤大小，計算腫瘤體積。V=a×b2×1/2(V為腫瘤體積，a為腫瘤的最長徑，b為腫瘤的最短徑)

1.4.2 實驗分組及干預 按照腫瘤建模要求(腫瘤平均重量≥1 g或20%腫瘤重量≥400 mg)衡量，32只BALB/c小鼠均造模成功。于第10天稱量小鼠重量，測量腫瘤大小，隨機分為對照組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組8只。對照組瘤內注射0.5 mL生理鹽水、低劑量組瘤內注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×107/mL)、中劑量組瘤內注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×108/mL)、高劑量組瘤內注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×109/mL)。每天觀察小鼠的一般情況，每周3次定時稱小鼠重量，每周2次測腫瘤大小，繪制小鼠重量變化、腫瘤體積變化曲線，比較組間差異。

1.4.3 采集標本 實驗干預后第12天處死全部小鼠，剝離腫瘤、肝、肺、脾、腦、腎、脾臟、胸腺，腫瘤拍照記錄，稱腫瘤重量、脾臟和胸腺質量，用于HE染色的組織置4%多聚甲醛固定，其余組織置-80 ℃保存。計算抑瘤率、脾臟指數、胸腺指數。抑瘤率=(細菌干預組瘤重-生理鹽水組瘤重)/細菌干預組瘤重×100%；脾臟(胸腺)指數(mg/10g)=脾臟(胸腺)質量mg/(小鼠重量g×10)。

1.4.4 細菌培養及鑒定 取剝離的一部分腫瘤、肝、脾、肺、腎、腦組織直接涂片后行革蘭染色，一部分涂布接種于哥倫比亞血瓊脂培養基，37 ℃厭氧培養72 h，觀察細菌情況。按照試劑盒說明書操作步驟提取組織DNA，根據GenBank中查得的C.novyi-NT序列(Gene ID: CP000382.1) ，由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成引物(上游引物：5′-TGCCCCTTATGTCTAGGGCT -3′,下游引物：5′-CGACTTCACCCCAATCACCA -3′)，PCR擴增產物長度為292 bp。用提取的C.novyiDNA作為模板進行PCR擴增，預變性 95℃ 5 min，變性 95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸 72℃ 20 s，30個循環，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.4.5 腫瘤和主要臟器組織HE染色 將固定24 h的組織取出，梯度脫水，常規石蠟包埋，切片后行HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤細胞、組織壞死及炎癥反應情況。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 荷瘤鼠干預后一般情況、體重變化

干預第2天高劑量組小鼠腫瘤部位均可觀察到小紅點，其他組無明顯變化，隨后實驗組小鼠腫瘤部位出現紅腫、壞死。小鼠活動量減少，精神一般，飲食、飲水量減少。隨著時間延長，局部炎癥反應減輕，部分腫瘤縮小。小鼠重量變化為:生理鹽水組小鼠的重量持續增加；低劑量組小鼠重量前3天變化不大，隨后持續增加；中劑量組小鼠重量前8天呈增加趨勢，且第3～8天變化較大，第8～12天變化不明顯；高劑量組小鼠重量前3天呈下降趨勢，隨后開始快速增加。小鼠干預前和處死后體重情況見表1，高劑量組小鼠體重與生理鹽水組、中劑量組的差異均有統計學意義(P=0.033，P=0.001)；低劑量組小鼠體重與中劑量組比較，差異也有統計學意義(P=0.049)。小鼠體重結果分析顯示，中劑量組8只小鼠中有5只體重明顯大于其他組。

表1 各實驗組荷瘤小鼠體重變化

2.2 腫瘤重量、體積及抑瘤率

剝離腫瘤時可見生理鹽水組腫瘤較大，顏色較鮮艷，有較多紅色液體，黏連嚴重。與生理鹽水組比較，中劑量組腫瘤顏色較淺，壞死區較大，炎性滲出物多，部分腫瘤包膜完整，與周圍組織黏連較輕；高劑量組腫瘤壞死區大，豆腐渣樣組織較多，有臭味，黏連嚴重。腫瘤體積結果顯示，中劑量組腫瘤體積第3～8天呈增加趨勢，且增加速度快，第8～12天變化較小；其他各組腫瘤體積持續增加，第3天后增加更快。腫瘤重量結果顯示，中劑量組約50 %的腫瘤重量比其他組小。中劑量組腫瘤重量與生理鹽水組、低劑量組和高劑量組比較均有統計學意義(P=0.006，P=0.015，P=0.041)。根據抑瘤率計算公式計算可得C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組的抑瘤率分別為8.49%、44.59%和14.84%(表2)。

表2 各實驗組腫瘤重量、體積及抑瘤率(N=8)

2.3 腫瘤和主要臟器細菌培養及鑒定

剝離的腫瘤及臟器組織涂片后行革蘭染色，腫瘤組織標本油鏡下可見大量棒狀或桿狀細菌，被染成紫色，其他組織標本未觀察到C.novyi。腫瘤及臟器組織細菌培養結果顯示，接種腫瘤組織的平板內見可疑C.novyi菌落外，高劑量組肝組織標本見可疑C.novyi，其他組織標本均未見C.novyi菌落。菌落行革蘭染色，油鏡觀察顯示腫瘤組織標本有大量C.novyi，高劑量組肝臟標本有少許可疑C.novyi。提取各組織DNA，測定DNA濃度后，再經PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳結果顯示除腫瘤組織標本有陽性條帶外其余均無陽性條帶。

2.4 腫瘤和主要臟器組織HE染色

小鼠皮下腫瘤組織行HE染色后光學顯微鏡下觀察，可見腫瘤細胞形態多樣，大小不一，核深染，核大小、形態、染色不一，核漿比例增大。生理鹽水組未見明顯組織壞死；C.novyi-NT組均可見組織壞死，中劑量組壞死組織呈粉染、不規則顆粒狀，邊界不規則，邊緣見慢性炎性細胞浸潤；高劑量組壞死組織伴少量慢性炎細胞浸潤和出血(圖1)。肝、肺、腎組織HE染色均未見腫瘤轉移灶。

2.5 脾臟指數和胸腺指數

完整剝離脾臟和胸腺，肉眼可見部分小鼠的脾臟明顯增大。生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組脾臟平均質量依次增大，分別為(0.284±0.076)g、(0.383±0.108)g、(0.441±0.177)g和(0.636±0.137)g，中劑量組、高劑量組與生理鹽水組脾臟質量比較差異有統計學意義(P=0.022，P<0.001)，高劑量組、中劑量組和低劑量組脾臟質量比較差異有統計學意義(P=0.004，P=0.017)。生理鹽水組、低劑量組、中劑量組和高劑量組脾臟指數分別為(0.954±0.266)、(1.230±0.359)、(1.463±0.596)和(2.183±0.405)，高劑量組脾臟指數明顯大于其他組，與生理鹽水組、低劑量組、中劑量組脾臟指數比較差異均有統計學意義(P<0.001，P=0.001，P=0.003)，中劑量組與生理鹽水組脾臟指數比較差異也有統計學意義(P=0.026)。C.novyi-NT中劑量組胸腺平均質量最大，生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組胸腺質量分別為(0.162±0.034)g、(0.147±0.019)g、(0.167±0.028)g和(0.118±0.017)g，高劑量組胸腺平均重量最小，與生理鹽水組和中劑量組比較差異有統計學意義(P=0.004，P=0.001)。生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組胸腺指數分別為(0.520±0.118)、(0.500±0.101)、(0.566±0.093)和(0.422±0.008)，各組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各實驗組腫瘤組織HE染色(×200)

3 討 論

肝癌是我國最常見的五大惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤第二位[12]。我國每年新發肝癌病例數占全球總數的50%左右，肝癌已成為嚴重威脅人類健康和制約社會發展的重大問題[13]。手術、化學藥物治療、放射治療、射頻消融等仍是肝癌治療的主要手段，但都不能顯著延長患者的生存周期[14]。肝癌的既往研究主要集中在癌細胞本身，包括癌細胞基因和抑癌基因的改變、分化程度和表型的改變等。隨著研究的深入，發現肝癌的微環境在肝癌的發生、發展及預后中同樣起著非常重要的作用[15-18]。氧含量低、血供差是肝癌微環境的普遍特征。藥物需要隨血液到達作用部位，且要達到一定的濃度才能發揮殺腫瘤細胞的作用，放射線也需要氧發揮細胞毒性作用[19]。氧含量低、血供差的特殊微環境有利于腫瘤細胞的生存和轉移，而限制了傳統的腫瘤化學藥物和放射治療方法[20]。研究者們開始思考，能否破壞或有效地利用此特殊的微環境呢？1813 年，Vautier觀察到腫瘤患者感染氣性壞疽后，腫瘤生長減緩甚至消退，這一現象引起了人們對細菌抗腫瘤的關注。Coley等[21]做出了積極的探索，卡介苗已成功用于臨床治療淺表性膀胱癌。2001年，Dang等[7]從26株細菌中篩選出野生型C.novyi具有高度腫瘤靶向定植能力，后續研究發現C.novyi-NT具有強大的溶瘤效應。

既往研究中，有研究者選擇了C.novyi-NT靜脈注射[7-9,11,22]，另有研究者則選擇了瘤內注射[7,10]。靜脈注射容易產生全身反應(25%～30%)，到達腫瘤部位的細菌太少[9]。同時，部分細菌在血液中丟失或死亡，無法有效發揮抗腫瘤作用，而瘤內直接注射就解決了此問題。此外，瘤內注射比傳統的局部治療(如手術、放療)更簡單，易操作。瘤內注射C.novyi-NT還能引起局部炎癥反應和抗腫瘤免疫反應[9]。所以，本研究選擇的是瘤內注射途徑。

肝癌是消耗性疾病，荷瘤小鼠重量變化可以反映小鼠自身狀況(體重)和腫瘤重量變化的最終結果。荷瘤小鼠重量變化顯示，C.novyi-NT中劑量組小鼠重量前8天呈增加趨勢，隨后小鼠重量變化不大，可能是細菌定植后，發揮溶瘤作用，腫瘤生長受抑制或變緩，小鼠體重降低減慢的結果。而高劑量組小鼠重量前3天呈下降趨勢，隨后持續快速增加，可能是因為C.novyi-NT劑量太大，發揮溶瘤作用迅速，產生的大量代謝產物及導致的強烈炎癥反應對小鼠產生不良影響，此變化趨勢與小鼠一般情況(高劑量組最差)和腫瘤局部變化一致。小鼠體重結果顯示，高劑量組顯著低于生理鹽水組和中劑量組。腫瘤大范圍較快地溶解，易引起嚴重的毒血癥，出現腫瘤溶解綜合征，甚至導致實驗動物死亡[5]。這可能是高劑量組小鼠一般情況差的原因。

按照抗腫瘤藥物藥效學指導原則，只有當抑制率>30%才能評定該藥物對腫瘤有一定療效。本實驗結果顯示中劑量組抑瘤率達44.59%，而其他組均低于30%，所以可以判定中劑量C.novyi-NT對免疫正常小鼠皮下H22移植瘤有療效。

研究C.novyi抗腫瘤效應，細菌的轉移是不可忽視的問題。本研究中，各組小鼠的肝、脾、肺、腎、腦組織DNA鑒定均未發現C.novyi定植，但高劑量組肝臟標本細菌培養和革蘭染色可見可疑C.novyi，分析其原因可能是操作污染所致或因劑量太大少量細菌經血液到達肝臟，但經肝組織細菌DNA提取后PCR檢測無C.novyi，可以判定C.novyi-NT瘤內注射是安全的。C.novyi能選擇性地靶向定植于H22移植瘤的乏氧區，而不轉移至其他組織的可能原因有：腫瘤細胞生長速度快，而瘤內血管形態不規則，血流紊亂，導致肝癌內部缺氧，形成乏氧微環境，為C.novyi生長繁殖提供了理想條件；腫瘤細胞代謝旺盛，產生大量代謝產物，為C.novyi生長提供了豐富的營養物質，C.novyi在瘤內比正常組織的增殖能力更強，更易在腫瘤內富集；肝癌血管分布和結構異常、腫瘤組織間隙的高壓使瘤內免疫細胞、抗體、補體等數量減少，功能的發揮受到抑制，C.novyi在瘤內較難被免疫系統識別、清除[5]。

免疫器官質量的變化可作為判斷藥物對免疫系統影響的指標之一。本研究分析了各組胸腺、脾臟的質量及胸腺、脾臟指數的差異，結果顯示中劑量組脾臟質量和指數顯著大于生理鹽水組。脾臟質量和指數不能完全反映免疫系統的活化程度，但脾臟是B細胞發育、分化的場所，B細胞與體液免疫有關，后續實驗應借助流式細胞術檢測免疫細胞亞群，全面評價諾維氏梭菌瘤內注射后對H22移植瘤小鼠免疫系統的影響。

綜上所述，C.novyi-NT能選擇性地定植于肝癌乏氧區，中劑量(1.0×108/mL，0.5 mL)C.novyi-NT能有效抑制免疫正常小鼠H22皮下移植瘤。C.novyi-NT抗H22移植瘤的作用機制可能是細菌局部定植腫瘤乏氧區后，其菌體成分和代謝產物本身具有細胞毒性，直接對腫瘤細胞發揮殺傷作用，也可能是C.novyi誘發腫瘤相關炎癥反應和抗腫瘤免疫反應間接發揮殺傷腫瘤細胞的作用[5,23]。C.novyi能在腫瘤組織中優先增殖，與腫瘤細胞競爭微環境中的營養素和生長因子；C.novyi分泌的蛋白水解酶、脂肪酶等破壞腫瘤細胞；細菌代謝產物(如磷脂酶C、脂質體酶、毒素)破壞腫瘤微環境[24]；C.novyi菌體成分刺激白細胞增殖分化，誘發TNF-α等細胞因子的釋放，從而增強小鼠的免疫應答能力；C.novyi聚集于腫瘤部位，引起局部炎癥反應，富集大量特異性與非特異性免疫效應細胞，誘導了與腫瘤抗原有關的交叉免疫以及抗腫瘤免疫反應。肝癌的治療方法包括肝切除術、肝移植、經導管動脈化療栓塞術、射頻消融、分子靶向治療等，但總體療效并不高[25]。本研究豐富了C.novyi抗腫瘤的種類，拓展了腫瘤生物治療的新思路，為深入探討C.novyi治療肝癌奠定了重要基礎，后續將圍繞乏氧微環境及炎癥反應和抗腫瘤免疫探索其可能的機制。

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