微生物菌肥對羅漢果根結線蟲和土壤酶活性的影響

馮世鑫 蔣妮 陳乾平 蔣水元 唐輝

(1廣西壯族自治區藥用植物園廣西南寧530023;2廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所廣西桂林541006)

羅漢果［Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey］為葫蘆科羅漢果屬植物，也是藥食兩用甜味植物，其果實為常用大宗藥材。主產于中國廣西，廣東、福建有引種。羅漢果含羅漢果甜苷、黃酮、維生素等活性成分，具有清熱潤肺、利咽開音、潤腸通便等作用［1］。羅漢果甜苷是一種低熱量高甜度天然甜味劑，其甜度堪稱世界之最［2］；除作中藥制劑以外，還可將其提取加工成為一種新型甜味劑，廣泛應用于保健品、飲料之中。羅漢果產品暢銷全國和歐美國家，成為當地經濟收入主要來源。

羅漢果的生產過程受根結線蟲病的嚴重影響，常造成生長不良、萎蔫、甚至死亡。有研究報道，在不使用殺線農藥的情況下，根結線蟲發病率高達86.67%，其病情指數達61.78%［3］，植株受為害后，枯萎病、根腐病等土傳性病害發生嚴重，造成復合侵染［4］。根結線蟲病感染所造成的減產輕者為15%～30%，重者達60%～70%［5］，嚴重制約著羅漢果產業的發展。羅漢果根結線蟲病病原主要為南方根結線蟲（MeloidogyneincognitaChitwood）［6］，是一種定居型內寄生線蟲，分布于10～30 cm土層，一年發生4～6代，世代重疊，常以卵和2齡前幼蟲隨病株殘體遺留在土壤中越冬，以2齡幼蟲侵入根內；以病土、灌溉水、病苗、農具，以及施用未腐熟農家肥方式傳播。生產上，常使用滅線磷（ethoprophos）、米樂爾（isazofos）、克線磷（nemacur）、氯化苦等高毒、高殘留農藥來防治，且藥劑用量逐年加大，造成產品農殘超標和環境污染，已威脅到人類身體健康。許多相關學者致力于動植物和微生物及其代謝物的殺線劑研發。微生物菌肥主要是通過微生物的生命活動使作物獲得特定的肥料效應或生防效應［7］。目前以擬淡紫青霉、哈茨木霉菌劑對根結線蟲病防治效果較好，但應用于大田時則防效較低［8-9］。改良型微生物菌肥是本研究組自主研制的產品，是以桐麩、油茶麩和蓖麻籽為主體，殖入長柄平菇菌、枯草芽孢桿菌，并增加低聚殼聚糖、有機硒等發酵精制而成，為植物源與微生物源相結合的功能性微生物菌肥，初步發現該菌肥具有促進植物生長和抑制線蟲活性的作用。為更好地開發和利用這一微生物菌肥，在室內毒力試驗的基礎上，探討其在大田中對羅漢果根結線蟲病的防治效果及對土壤酶活性的影響，為促進羅漢果產業發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地概況

試驗于2019年4月在廣西壯族自治區桂林市永福縣永福鎮漁洞村進行。試驗地為連作3年種植羅漢果的地塊，該地塊為丘陵地，沙質壤土，含有機質11.67 g/kg，全氮0.29 g/kg，堿解氮87.65 mg/kg，速效磷39.47 mg/kg，速效鉀104.26 mg/kg，pH 6.3。

1.1.2 材料

試驗所用的改良型微生物菌肥（以下簡稱為微生物菌肥）由廣西藥用植物園自主研制；淡紫擬青霉顆粒劑由北京德瑞福科技開發有限公司生產，有效菌數為0.2×108cfu/g；復合肥由歐洲化學安特衛普公司生產，中國中化集團有限公司提供的獅馬牌復合肥，含氮15%、磷15%、鉀15%。種苗為廣西藥用植物園培育的普豐青皮羅漢果扦插苗。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

設置微生物菌肥施肥水平如下：T1，1 kg/株；T2，2 kg/株；T3，3 kg/株；T4，4 kg/株。以淡紫擬青霉顆粒劑47 g/株＋復合肥0.5 kg/株的處理作為對照（為體現“改良的微生物肥”是在現階段水平下的創新，選用淡紫擬青霉顆粒劑作對照）。羅漢果種植的株行距為2.0 m×2.5 m，以土堆的形式種植。將各處理的肥料總量一次性施入，與土堆中的土拌勻后，用黑色地膜覆蓋，四周壓緊。種植時，在土堆的頂部將地膜開口，開淺坑，將袋裝種苗去除營養袋后植入，輕壓，淋水。小區面積為45 m2，3次重復。

1.2.2 性狀測定

1.2.2.1 土壤蟲口減退率

在處理前和處理后的40、80、120 d分別取根際土壤100 mL，用改良貝爾曼漏斗法分離線蟲；在解剖鏡下，調查根結線蟲2齡幼蟲的數量，計算各生長時期2齡幼蟲蟲口退減率（簡稱蟲口減退率，下同）。計算公式如下：

蟲口退減率＝（處理前2齡幼蟲數－處理后2齡幼蟲數）/處理前線蟲數量×100%

1.2.2.2 土壤酶活性測定

在處理后的40、80、120 d分別取根際土壤，測定脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性。參照朱新玉等方法［10］，采用靛酚比色法測定脲酶活性；用磷酸苯二鈉法測定磷酸酶的活性；用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性。

1.2.2.3 防效調查

在11月果實采收后，將根部挖出，用清水洗凈，查看根部出現根結的數量，計算根結發病株率、病情指數和相對防效。根結分級標準［11］分為0～6級，具體如下：

0級，無根結；

1級，10%以下的根出現根結；

2級，10%～20%的根出現根結；

3級，21%～40%的根出現根結；

4級，4l%～60%的根出現根結；

5級，61%～80%的根出現根結；

6級，8l%～100%的根出現根結。

計算公式為：

根結發病株率＝根結發病株數/調查株數×100%

病情指數＝Σ（病級數×該級發病株數）/（調查總株×最高級數）×100

相對防效＝（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%

1.2.2.4 果實產量和有機硒含量的測定

在果柄變黃時，分批采收，統計結果數量，參照中華人民共和國農業行業標準羅漢果（NY/T694）方法分級，計算中大果比率。后熟7 d后，烘烤至干；隨機選取30個中果，測定單果重和硒含量，硒含量參照GB 5009.93—2017《食品安全國家標準》中的氫化物原子熒光光譜法測定。

1.2.3 數據處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行數據處理，用Duncan’s法分析檢驗顯著性。

2 結果與分析

2.1 微生物菌肥對羅漢果根結線蟲病的抑制作用

試驗結果表明，施用微生物菌肥可顯著降低土壤中根結線蟲2齡幼蟲的數量，蟲口減退率有隨著施肥水平的增加而增大的趨勢，其中T4處理在施用80 d時蟲口減退率最高（表1），達到67.8%，顯著高于對照；其次為T3，在施用40和80 d時，T3與T4的蟲口減退率差異不顯著；到了120 d時，T3處理的蟲口減退率則顯著低于T4的，說明微生物菌肥對土壤線蟲的抑制持久性與施用水平呈正相關性。在同一處理中，隨著施肥后時間的延長，4個處理的蟲口減退率均表現出先升后降的變化趨勢，均在施肥后80 d達到頂峰，之后皆有所下降；施用120 d時，與80 d相比，T4蟲口減退率下降2.1%，T3下降3.2%，T1下降幅度最大，達到8.7%。說明微生物菌肥要發揮最大的作用需要一定的時間，但超過一定的時限后對羅漢果根結線蟲抑制作用出現衰減，施肥量較大的處理比施肥量小的衰減幅度小。在采收后，對植株根部受害情況的調查結果顯示，根結發病株率、病情指數均有隨著施肥水平的提高而降低，各處理間的差異達到顯著水平。以T4處理的相對防效最高，達到77.14%。

2.2 微生物菌肥對土壤酶活性的影響

脲酶廣泛存活于土壤中，參與有機氮的轉化，其活性增強促進有機氮的水解和吸收。試驗發現，施用微生物菌肥后，根圍土壤的脲酶活性在一定程度上得到增強，在不同時期所表現的活性不盡相同。在施用后40和80 d時，各處理的脲酶活性均顯著高于對照，并隨著施用量的增加呈先增后降的趨勢，其中以T3處理的活性最高。隨著時間的推移，在施肥后120 d時，T4土壤脲酶活性反高于T3處理的，表現為隨著施肥水平的增加而升高，兩者差異不顯著，但此時T1處理的脲酶活性已與CK基本持平（表2）。反映出在一定時間內，適量的菌肥有利于持續提高根際土壤的脲酶活性。

表1 微生物菌肥對羅漢果根結線蟲的發生調查表

磷酸酶為土壤中重要的作用酶之一，能促進有機磷化合物或無機磷酸鹽轉化，有利于植物對磷的吸收、利用。結果表明（表2），微生物菌肥能促進根際土壤磷酸酶活性的提高，磷酸酶活性隨著菌肥施用量的增加呈先升高后降低的變化趨勢，其中以T3處理較好，表現為在施用后80和120 d土壤磷酸酶活性均最高，其中在120 d時顯著高于對照和其他處理；其次為T2，T2表現為速效、早退，在施用后的40 d土壤磷酸酶活性較高，至80 d時磷酸酶活性也顯著高于CK、T1和T4處理，但與T3處理的差異未達到顯著水平；至120 d時T2酶活性顯著低于T3。T4處理表現為遲效，在施用后120 d磷酸酶活性呈現提升的態勢，與T2處理基本持平。說明中等量的微生物肥更有利于磷酸酶活性的提高。

表2 施用微生物菌肥對羅漢果土壤酶活性的影響

過氧化氫酶是土壤中的氧化還原酶之一，有助于過氧化氫的分解，降低土壤有害物質對生物體的毒害作用，其活性可反映出土壤腐殖質化程度和有機質轉化速率。從試驗結果（表2）可看出，在施用菌肥后的40、80、120 d，各處理的根際土壤過氧化氫酶活性均顯著高于對照，且均隨著微生物菌肥施用量的增加而升高，但不同時期各施肥處理的差異性不同。在施后40 d時，各處理之間差異不顯著；在施用后80 d時，以T4處理的過氧化氫酶活性最高，其次為T3處理的，二者之間差異不顯著，但顯著高于T1、T2；至120 d時，仍以T4處理最高，顯著高于其他處理。說明微生物菌肥可提高過氧化氫酶活性，隨著處理時間的延長，不同施肥水平下過氧化氫酶活性不同，水平越高酶活性越高。

2.3 微生物菌肥對羅漢果產量和硒富集的影響

市場上，羅漢果以果實大小定價，以個數計效益；在提取加工中，則以果實重量來算收，因此，結果數、中大果比率和果實重量均為羅漢果產量構成主要因素。試驗結果（表3）表明，施用微生物菌肥能促進羅漢果結果，結果數隨著施肥水平的提高而增大，以T4最高，顯著高于其他處理，與對照相比結果數提高37.6%。單果重也有隨著施肥水平的提高而增大，以T4處理為最大；其次為T3處理，T4和T3之間差異不顯著，但均顯著高于T2、T1處理；與對照相比，增加幅度達到24.4%。中大果比率隨著肥料水平的提高呈現先增加后降低的變化趨勢，以T3處理最高，與對照相比提高12.9%。其次為T4處理，兩者之間差異不顯著，但均顯著高于其他處理。可以看出，微生物菌肥能增加羅漢果結果數和果實重量，一定施用水平能提高中大果比率。

硒是人體必需的微量元素，是人體抗氧化酶和硒蛋白的重要組成部分［12］，具有抗脂質過氧化、保護生物膜、抗肝損傷的作用［13］，同時有提高人體免疫力和抗病毒感染的能力，在防治克汀病、心腦血管疾病、癌癥、肝病、糖尿病等方面均有較好的療效［14-15］。富硒羅漢果對肝臟具有較好的保護作用，綜合保健功能較好，倍受當今消費者的青睞。實驗結果表明，施用本試驗自主研制的改良型微生物菌肥，能顯著促進羅漢果對硒的富集，富集量隨著施肥水平的提高而增加，以T4最高，其硒含量達到1.02 mg/kg，是對照的18倍，產品均符合《富硒農產品硒含量分類要求》［16］之中藥材的要求，該標準中規定富硒中藥材含硒應為0.15～2.0 mg/kg。

3 討論

表3 微生物菌肥對羅漢果果實產量和硒含量的影響

根結線蟲病是一類危害大、分布廣、防治難的植物病蟲害，其發生是造成作物減產的直接原因，也是土壤質地變差，引發連作障礙的重要表征。以往高毒、高殘留的防治方法，嚴重阻礙了“綠色”農業的發展。尋找環境友好型的根結線蟲病防控技術是發展有機農業的必經之路。利用植物源活性物質防治植物寄生線蟲的研究逐漸受到重視和廣泛關注［17］，已有研究報道稱，許多植物對南方根結線蟲有毒殺作用［18］。本試驗中，使用的微生物菌肥以桐麩、油茶麩和蓖麻籽粉為基礎物質，含有生物堿、蓖麻毒蛋白和茶籽醇成分，對南方根結線蟲病有明顯的抑制作用，與前人［19-21］的研究結果相一致，也驗證，有機肥料本身或在腐解過程中產生有毒的次生代謝物質，可致使土壤病原物死亡［22］。

人為添加的有益菌能快速培養形成優勢菌群，直接致使土壤病原物死亡［23］，且能改變土壤微生物的營養結構，導致微生物間競爭、捕食關系加劇，對土傳病原物起到競爭和拮抗的作用［24］。此外，某些生物菌之間存在著協同作用［25］，加強了菌功能的作用效應。本試驗中，主要有益生物菌長柄平菇菌（Plurotusspodoleucus）和枯草芽孢桿菌（B．subtilis）協同作用，增強生物菌對羅漢果生長和根結線蟲病的抑制作用，與蔣妮［26］、丁國春［27］等研究結果相同。

利用功能性植物和微生物菌搭配制作而成的微生物菌肥，不僅能能植物本身活性成分或腐解過程分泌的有毒物質與功能微生物菌共同作用以抑制南方根結線蟲，又能為作物生長提供養分，改善土壤環境，活化肥素，促進作物生長，對羅漢果高質量生產具有十分重要的意義。