α1-抗胰蛋白酶基因3’UTR區功能及與COPD的關系研究

任 杰，李 黎（通訊作者），鐘雪梅，鄭愛芳，李菲菲，馬 濤

（新疆喀什地區第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科 新疆 喀什 844000）

1.資料與方法

1.1 細胞培養條件

DMEM+10% FBS，37℃、5% CO2飽和濕度培養

1.2 主要試劑

雙熒光素酶報告基因；PCR反應試劑盒，轉染試劑盒，定點突變試劑盒，限制性內切酶DNA NotI, XhoI, Taq DNA聚合酶。

1.3 Q-PCR引物設計

用目標基因SNP rs1051052-C設計引物，以所需擴增基因片段DNA為模板建立PCR反應體系，純化PCR產物；完善質粒擴增與抽提，酶切，連接和轉化，將質粒及引物結果與基因庫內3'UTR區域序列進行比對驗證，見表1。

1.4 雙熒光素酶報告基因實驗

1.4.1 載體構建 根據PCR擴增片段比對結果，將含有SNP rs1051052-G片段的PCR擴增產物通過限制性內切酶XhoⅠ、NotⅠ進行定點位切后與質粒構建載體HmiT104523-MT06，同時在CE Design Ⅴ1.03網站上設計SNP rs1051052-G定點突變引物，利用定點突變試劑盒進行G→C定點突變，并構建載體CS-HmiT104523-MT05-01。通過雙酶切與載體相應區域連接構建靶克隆對照載體CmiT000001-MT05，見表1。

表1 實驗所用引物序列

1.4.2 細胞轉染 分別將構建好的熒光素酶報告基因載體與雙熒光素酶基因結合，以高質量的質粒轉染靶細胞，將含有轉染細胞的培養液與轉染液輕柔混勻，用脂質體法共轉染48 h后，用化學發光儀測定熒光素發光度以顯示靶標活性。

1.4.3 miRNA干擾 利用snpinfo軟件預測SNP rs1051052-G位點潛在結合的miRNA,合成miRNA以及它的抑制劑，并用脂質體法轉染，定量檢測實驗組及對照組不同分組細胞熒光數值，鑒定miRNA作用靶點。

1.4.4 miRNA靶標活性檢測 分別檢測miRNA及miRNA mimics與報告基因載體的雙熒光素酶活性數值，反應對靶標的調控活性，見表2。

表2 Gluc和SEAP表達量及抑制率

2.結果

本實驗將miRNA mimics, miRNA mimics陰性對照，靶標克隆對照，3'UTR靶標克隆（野生型），3'UTR靶標克?。ㄍ蛔冃停┓謩e組合，將實驗分為六組（A組-F組），以海腎熒光素酶（GLuc）基因作為報告基因，分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因為內參基因，使用熒光素酶檢測法檢測活性，通過熒光素酶基因與Alpha-1-AT內參照基因拷貝數比值進行相應計算，不同組間報告基因活性的比較采用t檢驗，結果顯示miRNA mimics對野生型靶標的抑制效率約為38.94%（1～27.07%/44.33%），對突變型靶標的抑制率41.93%（1～28.41%/48.92%），抑制效率并無明顯差異（P＞0.05），提示SNP rs1051052-G位點靶標位點的突變不顯著影響miRNA對靶標的抑制作用。

進一步將3'UTR靶標克隆野生型、3'UTR靶標克隆突變型與對照組分為三組（G組-Ⅰ組）進行檢測及對比，結果顯示miRNA mimics對靶標克隆野生型及靶標克隆突變型的抑制效率為分別為52.65%（1～47.35%）、53.01%（1～44.99%）（P＜0.05），結果顯示可能存在其他內源性物質對野生型靶標及突變型靶標存在明顯的抑制作用。

3.討論

慢性阻塞性肺病是基因多態性和環境因素共同作用的結果[1]，以不完全可逆性氣流受限為表現，將成為全球第五位因病死亡原因，社會經濟負擔重，目前，破譯COPD易感位點的功能機制，為臨床提供治療靶點，是目前的研究熱點和難點。

在眾多基因中，蛋白質編碼基因占總基因的比例＜2%[2]，很大一部分被轉錄成非編碼基因，α1-AT基因位于14q32.1，編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑，是較為確定的與COPD相關的易感基因[3]，但α1-AT基因3'UTR區域如何調控和影響COPD的發生發展，尚不明確[4]；為進一步明確SNP rs1051052-G位點與miRNA之間的功能關系及如何影響COPD的發生發展，本研究結合相關生物信息學分析以及功能實驗進行探究。

3’UTR區域為非編碼區，是真核生物基因的重要結構成分，主要功能涉及基因的表達調控，miRNAs是通過相應靶基因與mRNA中3’UTR不完全配對結合在轉錄后水平負調控基因表達[5]從而影響mRNA的穩定性，導致mRNA的抑制或降解，最終影響基因表達。

不同暴露條件下的COPD患者miRNA存在不均一表達性，有對照研究結果顯示，不同組織暴露于煙霧24周后，肺組織中有31個miRNA表達下調，灌洗液中有78個miRNA表達上調[6]。進一步研究發現，吸煙可誘導循環miRNAs的差異表達，miR-149-3p等miRNA的下調可通過調節TLR-4/NF-κB信號通路增加IL-1β和TNF-α的分泌，增強COPD患者的炎癥反應[7]。

研究發現維吾爾族人群攜帶rs1051052-G等位基因可能有較高的COPD患病風險[8]，本研究進一步利用雙熒光素酶基因檢測，通過miRNA和miRNA抑制劑轉染細胞證實比對，明確SNP rs1051052-G位點突變不特定影響相關miRNA對靶標的抑制作用，但本實驗的目的靶標存在一定的抑制表現，可能細胞本身存在內源性miRNA或內源性物質對野生型及突變型靶標存在明顯的抑制作用，但尚不能確認是哪種或哪幾種miRNA起到調控作用，需要進一步實驗研究探討。

綜上所述，本研究初步解析了非編碼區SNP rs1051052-G調控基因表達的分子機制，完成了靶標位點的功能驗證，有助于為進一步了解遺傳因素對維吾爾族COPD發病的影響，尋找一些潛在的miRNA生物標志物信息，為提供個體差異的診斷及治療提供參考。