治療子宮內(nèi)膜異位癥的化瘀散結(jié)灌腸液活性成分篩選及其靶基因生物學(xué)功能分析

徐信，宗春曉，邢玉，徐立，祝潔，薛曉鷗

1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；2清華大學(xué)玉泉醫(yī)院；3北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在宮腔被覆內(nèi)膜以外存活并擴散的一種具有侵襲、種植等類似惡性腫瘤生長特性的良性疾病［1-4］。據(jù)文獻報道，育齡期女性中EMs發(fā)生率5%～10%［5］，合并不孕癥的為20%～30%［6］，并發(fā)慢性盆腔痛（CPP）的患者高達50%左右［7］。化瘀散結(jié)灌腸液為《醫(yī)宗金鑒》桃紅四物湯基礎(chǔ)之上化裁而成，具有活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結(jié)之功［8］。中藥保留灌腸是一種傳統(tǒng)、有效的給藥途徑，其可避免肝臟首過效應(yīng)，減輕藥物對胃腸道的刺激［9］，同時，藥物能夠直達病灶，易于吸收、達峰時間短、起效迅速［10］。近年，臨床實踐驗證其對EMs具有良好的治療作用［8］，《2019年子宮內(nèi)膜異位癥中西醫(yī)結(jié)合診治指南》中也對化瘀散結(jié)灌腸液進行強推薦，且專家共識度高達90.48%。然而，化瘀散結(jié)灌腸液中藥成分復(fù)雜多樣，其作用機制尚未見報道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興藥理學(xué)研究方法，它涵蓋了系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科技術(shù)［11］，具有整體性及系統(tǒng)性的特點，這也與中藥組方配伍重視整體觀的原則十分契合［12］，顛覆了既往單靶點機制通路難以詮釋中藥復(fù)方多成分、多靶點協(xié)同作用的狀況［13］。目前，越來越多關(guān)于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究成功應(yīng)用于中藥的機制探究，從宏觀整體和微觀機制闡釋了中藥多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的科學(xué)內(nèi)涵［11-15］。2020年1—9月，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，針對化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的靶基因和機制進行了探索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.gene‐cards.org）；STRING 11.0在線平臺（https：//stringdb.org）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8）；Cyto‐scape（版本：3.7.2）。

1.2 化瘀散結(jié)灌腸液活性成分的篩選化瘀散結(jié)灌腸液包含當(dāng)歸、川芎、赤芍、熟地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術(shù)、丹參、鱉甲、龜板、木通、連翹、金銀花15味中藥。首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找中藥所包含的化學(xué)成分［16］，對于未收錄的鱉甲、龜板則檢索中國知網(wǎng)相關(guān)文獻進行補充，構(gòu)建化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。但數(shù)據(jù)庫冗余龐雜，故引入ADME［17］進一步篩選其發(fā)揮藥效的重要活性成分。

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫的ADME預(yù)測功能，對建立的化學(xué)成分庫進行活性成分篩選，此次研究藥品為灌腸液，因此篩選其腸上皮吸收好、與上市藥品中藥物接近程度高、生物利用度（OB）好的化學(xué)成分為活性成分［18］。設(shè)定的復(fù)合模型參數(shù)：腸上皮通透性（Caco-2 permeability，Caco-2）≥0.4、類藥 性（druglike，DL）＞0.36、OB≥30%。

1.3 化瘀散結(jié)灌腸液活性成分靶基因預(yù)測基于ADME獲得的活性成分，進一步通過TCMSP平臺預(yù)測其作用的靶標。得到的作用靶標統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行名稱規(guī)范。整理數(shù)據(jù)并刪除重復(fù)值后，所得結(jié)果即為化瘀散結(jié)灌腸液的活性成分靶基因。

1.4 治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液作用靶基因篩選以美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（Nation‐al Center for Biotechnology Information Search data‐base，NCBI）的Mesh主題詞表查詢EMs全面、規(guī)范的表達，得到“Endometriosis”、“Endometrioses”及“En‐dometrioma”作為EMs的關(guān)鍵詞，進而檢索Gene‐Cards數(shù)據(jù)庫，獲取與EMs相關(guān)的靶基因。

利用R語言將二者（藥物活性成分靶基因與疾病靶基因）取交集并繪制維恩圖，從而確定化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的作用靶基因，并將交集靶點信息提交至STRING 11.0在線平臺，生物種類設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（置信度＞0.9），其余為默認設(shè)置，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型［19］。

PPI通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化呈現(xiàn)及分析，使用“CytoNCA”計算拓撲參數(shù)，并以連接度值（以Degree排序，其前十）作為節(jié)點重要性的量化參考，進而篩選藥物治療疾病的重要靶基因。

1.5 化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的重要靶基因生物學(xué)功能及信號通路分析將預(yù)測的化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的交集靶基因，利用DAVID［20］進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，尋找出化瘀散結(jié)灌腸液中治療EMs參與調(diào)控的信號通路及相關(guān)生物學(xué)過程，并以R語言繪制條形圖及氣泡圖。其中GO富集分析涵蓋分子功能（MF），細胞組分（CC）和生物過程（BP）三個部分［21］。

2 結(jié)果

2.1 化瘀散結(jié)灌腸液的活性成分及活性成分靶基因TCMSP數(shù)據(jù)庫查找的化瘀散結(jié)灌腸液所含中藥的化學(xué)成分：桃仁66個，紅花189個，當(dāng)歸125個，川芎189個，赤芍119個，熟地黃76個，川牛膝41個，三棱30個，莪術(shù)81個，丹參202個，木通43個，連翹150個，金銀花236個。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的中藥，以CNKI收錄的相關(guān)文獻進行補充，其中龜甲和鱉甲所含的化學(xué)成分分別為20、16個；基于TC‐MSP數(shù)據(jù)庫的Caco-2、DL、OB參數(shù)共篩選出82個活性成分，刪除重復(fù)項為58個活性成分，包括β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、菜油甾醇等。得到的中藥活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測其潛在作用靶點，刪除重復(fù)項后得到110個化瘀散結(jié)灌腸液潛在作用靶基因，主要靶基因為PGR、NCOA2、PTCS2、SCN5A等。

2.2 治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液作用靶基因及重要靶基因最終獲得與EMs發(fā)病相關(guān)的靶基因1 446個。利用R語言相映射篩選出藥物活性成分靶基因與EMs相關(guān)基因的交集靶基因（重要靶基因），從而確定治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液55個作用靶基因。

PPI網(wǎng)絡(luò)中共涉及45個節(jié)點，197條邊，進一步根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)對節(jié)點重要度進行排序，其中排名靠前的依次為STAT3、JUN、TP53、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK14、FOS、ESR1、RELA等，見圖1。

2.3 重要靶基因的生物學(xué)功能及信號通路重要靶基因涵蓋BP 156條，CC 19條，MF 36條。GO生物學(xué)功能富集分析表明化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的藥效機制主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、雌二醇應(yīng)答、缺氧反應(yīng)等生物過程；細胞核、細胞質(zhì)等重要的細胞組分；蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。

圖1 治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液作用靶基因PPI圖

重要靶基因參與65條相關(guān)通路，包括癌癥相關(guān)信號通路、TNF信號通路、自噬、HIF-1信號通路（HIF-1）及PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt）等，其中癌癥相關(guān)信號通路不僅涵蓋交集靶標數(shù)量最多，且P值也最小，表明與交集靶點集合顯著相關(guān)。

3 討論

中醫(yī)古籍中并無EMs病名的記載，根據(jù)其臨床癥狀歸屬于“婦人腹痛、痛經(jīng)、癥瘕”等疾病范疇。EMs雖為婦科良性疾病，卻具有類似惡性腫瘤的生物學(xué)特點，且復(fù)發(fā)率高，臨床治療棘手，對女性的身心健康及生存質(zhì)量造成嚴重影響，故研究此病的治療具有重要的臨床價值和廣泛的社會學(xué)意義［22］。目前臨床上針對本病，尚缺乏理想的治療方法，手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高，西藥治療不良作用多［23］。中醫(yī)藥強調(diào)整體觀念，治療EMs具有一定優(yōu)勢，臨床研究亦表明，化瘀散結(jié)灌腸液能有效緩解疼痛、降低CA125水平、改善患者生活質(zhì)量［8］，但尚鮮有相關(guān)機制的報道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，得出化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的靶點及機制。

化瘀散結(jié)灌腸液中的15味中藥涵蓋了58個活性成分，通過作用于55個交集靶點發(fā)揮對EMs的治療作用，其中STAT3、JUN、TP53、AKT1、TNF、VEG‐FA等蛋白，經(jīng)拓撲參數(shù)分析，在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，說明化瘀散結(jié)灌腸液可能主要通過這些蛋白發(fā)揮對EMs的潛在治療作用。有研究表明，激活后的STAT3持續(xù)進細胞核內(nèi)，導(dǎo)致下游靶基因VEG‐FA高表達，可能通過促進局部病灶血管異常增生，導(dǎo)致EMs的發(fā)生［24］。TP53又名p53，是重要的抑癌基因。有研究表明，p53基因rs1042522位點多態(tài)性與EMs易感性相關(guān)［25-26］。馮婉琴等［27］發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p與AKT1基因在子宮內(nèi)膜組織中的表達呈負相關(guān)，且miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因影響EMs的發(fā)病。JUN即AP-1蛋白，是一種細胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通常由c-jun和c-fos蛋白以異源二聚體形式結(jié)合于啟動子區(qū)的AP-1位點上，與細胞的增殖與分化密切相關(guān)［27］。很多研究已證實AP-1參與腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，EMs具有類似的腫瘤的生物學(xué)特點，推測AP-1參與了EMs的發(fā)生、發(fā)展［28］。TNF是具有多種生物效應(yīng)的一類細胞因子，通過與細胞膜上的受體結(jié)合，激活TNF信號通路，從而調(diào)控細胞生長、分化、調(diào)亡和誘發(fā)炎癥等過程［29］，研究表明，異位內(nèi)膜可能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，促使腹腔液中巨噬細胞增加，誘發(fā)其產(chǎn)生大量的TNF-α，促使間質(zhì)細胞黏附、增殖，進而導(dǎo)致異位病灶［30-31］。可見，雖然目前EMs發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的機制仍未見定論，但可以看出多數(shù)研究的重點均依據(jù)EMs具有侵襲、轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的生物學(xué)特點進行展開。

此外，GO功能富集分析表明化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs藥效機制，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程；細胞核、細胞質(zhì)等重要的細胞組分；蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。KEGG通路富集分析主要通過癌癥、TNF、自噬、HIF-1及PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮藥效機制。其中癌癥相關(guān)通路（Path‐ways in cancer）不僅涵蓋交集靶標數(shù)量最多，且P值也最小，說明此通路與交集靶點集合顯著相關(guān)，進一步通過KEGG Mapper工具對通路圖進行標記，可見交集靶點廣泛分布于整個通路的進程，再次印證EMs所表現(xiàn)的惡性腫瘤的生物學(xué)特性仍是研究的重點。

綜上，治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液活性成分包括β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、菜油甾醇等，活性成分靶基因主要有PGR、NCOA2、PTCS2、SCN5A等，治療EMs的化瘀散結(jié)灌腸液重要靶基因主要有STAT3、JUN、TP53等基因，相關(guān)通路主要有癌癥、TNF、自噬等信號通路。本研究運用現(xiàn)代信息技術(shù)，將隱性的知識顯性化，系統(tǒng)挖掘化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的作用靶點及潛在作用機制，為深入闡釋化瘀散結(jié)灌腸液治療EMs的臨床研究及進一步實驗驗證提供了思路。但基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)本身的局限性等多方面因素，得出的結(jié)論有待后續(xù)臨床及實驗的進一步驗證與完善。