非酒精性脂肪性肝病患者乙醛脫氫酶2基因多態性變化觀察

柯月，張杰，梁燦燦，紀文靜

1新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊830000；2新疆維吾爾自治區人民醫院

隨著社會經濟的不斷發展、飲食結構的改變、生活節奏的逐漸加快以及工作壓力的提高，世界范圍內第一大慢性肝病及肝酶異常的首要病因隨之發生了巨大的變化，在我國由于逐年加強的慢性乙型肝炎防治力度，而導致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已取代其成為第一大慢性肝病［1-2］。NAFLD患者中有10%～15%為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），15%～25%的患者在其發病后10年內發生肝硬化，而脂肪性肝硬化患者發生原發性肝細胞癌、肝衰竭和移植肝復發的概率高達40%［3］，對患者、家庭及社會造成巨大的經濟負擔，已成為嚴重的社會公共衛生問題。目前較多研究表明，NAFLD的發病機制不僅與傳統危險因素相關（飲食、生活飲食習慣等），而且涉及胰島素抵抗、氧化應激、遺傳易感性等方面。NAFLD發病機制的研究日益成為肝病學的臨床研究熱點，越來越多的研究揭示了基因多態性與NAFLD發病的關系。乙醛脫氫酶2（ALDH2）是醛類物質代謝的關鍵作用酶，研究發現其可能通過調控氧化應激、線粒體功能、細胞凋亡以及代謝清除毒性醛類物質等多種途徑影響NAFLD及其并發癥的發生、發展［4-5］。但ALDH2與NAFLD的發生是否有關仍無定論，ALDH2與NAFLD傳統危險因素間是否存在相關性也少見報道。2019年5月—2020年11月，本研究通過對新疆地區NAFLD和健康體檢人群ALDH2基因多態性進行分析，觀察NAFLD ALDH2基因多態性的變化，并進一步分析ALDH2基因多態性與NAFLD發生的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料納入NAFLD患者130例（NAFLD組），符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）》中NAFLD的診斷標準。男72例、女48例，年齡55～75歲，漢族60例、維吾爾族60例，糖尿病史68例、高血壓病史56例，BMI（27.50±1.69）kg/m2、空腹血糖（5.62±0.72）mmol/L、糖化血紅蛋白（6.21±0.75）mmol/L、膽固醇（4.61±0.62）mmol/L、尿酸350.35（282.00～414.00）μmol/L，血清中谷丙轉氨酶（ALT）26.70（19.45～35.21）U/L、谷草轉氨酶（AST）水平28.36（20.45～36.34）U/L、谷氨酰轉肽酶（GGT）24.45（18.69～29.36）IU/L，總膽紅素、直接膽紅素及間接膽紅素分別為10.55（7.98～13.87）、4.04（2.71～5.52）、7.54（4.75～11.25）μmol/L。選取同期非NAFLD的健康體檢者作為對照組，年齡48～65歲，漢族30例、維吾爾族30例，糖尿病史17例、高血壓病史15例，BMI（25.87±1.67）kg/m2、空腹血糖（4.28±0.64）mmol/L、糖化血紅蛋白（5.75±0.80）mmol/L、膽固醇（3.98±0.82）mmol/L、尿酸324.97（262.00～383.00）μmol/L，ALT、AST、GGT分別 為25.18（18.02～32.45）U/L、26.23（19.78～34.16）U/L、22.70（17.78～28.23）IU/L，總膽紅素、直接膽紅素及間接膽紅素分別為10.52（7.72～13.68）、4.10（2.83～5.26）、7.11（4.62～11.08）μmol/L。除總膽紅素、直接膽紅素及間接膽紅素外，兩組其余指標比較，P均＜0.05。

1.2 ALDH2基因多態性分析采用離心柱法提取和純化DNA，將所獲取的基因片段進行PCR擴增，條件如下：反應體系25 μL，50℃、5min；90℃、5 min；94℃、25 s，60℃、25 s，72℃、30 s，35個循環；72℃、5 min。取5μL擴增產物，經瓊脂糖凝膠電泳（濃度1.5%），紫外線下觀察擴增產物為360 bp。取10 μL擴增產物，與芯片上檢測探針雜交并酶促顯色，經過BE-2.0生物芯片識讀儀掃描分析得出樣本的ALDH2基因型。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型分析各指標對NAFLD的影響及NAFLD患者ALDH2基因多態性與NAFLD傳統影響因素的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ALDH2基因型頻率及分布比較ALDH2基因型產物為288 bp片段。經測序檢測發現AL‐DH2基因表型共3種，分別為野生型GG、突變雜合型GA、雜合型AA（即ALDH2*1/1、ALDH2*1/2和ALDH2*2/2）。GG、GA和AA基因型分布頻率分別為56.1%、37.8%和6.1%，NAFLD組及對照組AL‐DH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，說明各樣本具有群體代表性。

NAFLD組野生型GG、突變雜合型GA、雜合型AA所占比例分別為49.2%（59/120）、43.3%（52/120）、7.5%（9/120）；對照組所占比例分別為70.0%（42/60）、26.7%（16/60）、3.3%（2/60），兩組ALDH2基因型分布差異有統計學意義（Z=-2.664，P＜0.01）。NAFLD組中漢族人群野生型GG、突變雜合型GA、雜合型AA所占比例分別為33.9%（20/60）、56.7%（34/60）、10.0%（6/60），維吾爾族人群所占比例分別為66.1%（39/60）、30.0%（18/60）、5.0%（3/60），不同民族ALDH2基因型分布差異有統計學意義（Z=-3.364，P＜0.01）。

2.2 ALDH2基因多態性與NAFLD患病風險及傳統危險因素的關系 以NAFLD為因變量，ALDH2基因型為自變量，同時將年齡、糖尿病史、高血壓病史、BMI、空腹血糖、GHb、TG、TC、UA、ALT、AST、GGT等指標均納入自變量。結果顯示，GA/AA基因型79例，其中NAFLD患者61例，占77.2%，GG基因型101例，其中NAFLD患者59例，占58.4%，GA/AA基因型患NAFLD率明顯高于GG型（P＜0.05）。經單因素分析后將上述入選相關因素進行Logistic回歸分析，ALDH2基因多態性仍是NAFLD患病的獨立影響因素（OR=5.984，95CI%=1.016～35.237，P=0.048）。

通過無序多分類反應變量的Logistic回歸分析，結果顯示，NAFLD患者傳統影響因素與ALDH2基因多態性無關，詳見表1。

表1 NAFLD患者ALDH2基因多態性無序多分類反應變量的Logistic回歸分析結果

3 討論

NAFLD是代謝綜合征累及肝臟的臨床病理表現，由于其臨床缺乏特征性表現及針對性治療，近年其相關診治一直是臨床研究的熱點。鑒于肥胖及2型糖尿病的流行以及慢性病毒性肝炎的有效控制，NAFLD現已成為慢性肝病的主要原因［6-8］。國外有研究表明，遺傳基因多態性可作為NAFLD進展為肝硬化的危險因素，其中可確定一些基因突變與NAFLD疾病發展相關，在鑒定的相關位點中PNPLA3的非同義單核苷酸多態性證實存在多個患者群中［9-12］。

ALDH2基因位于人類第12染色體上，存在300多個單核苷酸多態位點（SNP）。研究顯示，ALDH2存在84個SNP位點，只有少數位點突變具有功能［13］，黃辰宇等［14］研究通過基因型檢測，發現總共有5個SNP位點與飲酒行為相關，其中相關性最強的是外顯子上的突變位點rs671。rs671在12號外顯子上，人群中有三種基因型組成，分別為ALDH2*1/ALDH2*1（野生型G/G），ALDH2*1/ALDH2*2（雜合型G/A），有10%～45%的催化活性，ALDH2*2/ALDH2*2（突變型A/A）幾乎失去活性［15］。ALDH2不僅為乙醇代謝的關鍵酶，并且為醛類物質代謝的重要代謝酶。近年不斷有新的假設被提出，指出NAFLD可能是內源性的酒精性脂肪性肝病（AFLD），內源性乙醇（EE）或許是造成肝臟細胞脂肪變性，引起氧化應激損傷的病因之一［16-17］。相關動物實驗和臨床研究均支持新的觀點，即乙醇代謝在NAFLD發展中扮演了重要的角色，乙醇代謝相關酶譜可能參與NAFLD的發病機制。國內外多項研究表明，ALDH2基因多態性與心腦血管疾病、糖尿病、酒精性脂肪肝、癌癥（胃癌、食道癌、腎癌）的發生具有相關性［18-19］，但針對ALDH2與NAFLD的相關性研究較為少見。同時較多國內學者對NAFLD相關危險因素進行報道，影響NAFLD發生、發展的傳統危險因素包括遺傳易感性、性別、生活方式、BMI、胰島素抵抗、尿酸、腸道微生態等。

本研究調查結果顯示，NAFLD組中ALDH2野生型GG、突變雜合型GA、雜合型AA所占比例分別為50.8%、41.7%、7.5%，對照組野生型GG、突變雜合型GA、雜合型AA所占比例分別為68.3%、28.3%、3.3%，兩組基因型分布差異有統計學意義。NAFLD組中不同民族ALDH2基因型分布亦存在差異，NAFLD漢族人群中，ALDH2 GA/AA型比例高于維吾爾族人群，國內外學者經研究提出ALDH2基因型分布在不同地域、種族間存在差異，全球范圍內ALDH2基因突變約占8%，主要集中在東亞地區，亞洲人群包括中國人中的突變率可達50%，明顯高于歐美白種人群［20-22］。國內有較多研究檢測各地區ALDH2基因型分布情況，結果可見ALDH2基因型分布在南北方人群中存在差異，但考慮本研究納入樣本量較少，且研究對象資料的代表性有所局限，今后可進一步在不同區域的人群中開展大樣本臨床研究。對NAFLD組及對照組的一般資料進行比較，發現NAFLD組合并高血壓、糖尿病、年齡、BMI、血脂、血糖、UA、GHb、TG、TC、ALT、AST及GGT水平明顯高于對照組。故將ALDH2基因多態性與上述指標一同作為自變量，進行多元Logistic回歸分析，研究結果顯示GA/AA基因型NAFLD患病率明顯高于GG型，ALDH2基因多態性是NAFLD患病的影響因素。為了解ALDH2基因多態性與NAFLD傳統危險因素間是否存在聯系，以NAFLD患者的ALDH2基因不同表型作為因變量，進行無序多分類反應變量的Logistic回歸分析，發現NAFLD患者傳統危險因素對ALDH2基因多態性無影響，提示兩者間無內在關系，與既往部分研究報道相符，說明ALDH2基因多態性為NAFLD發生、發展的獨立影響因素，與其他危險因素間不存在協同效應。

綜上所述，ALDH2基因GA/AA型在NAFLD患者中比例高，且不同民族間ALDH2基因突變的發生率存在差異；ALDH2基因突變與NAFLD具有相關性，且為NAFLD發生的危險因素，但與NAFLD傳統危險因素間無明顯關系。針對攜帶GA/AA型的高危人群，可考慮動態隨訪腹部超聲、血脂、肝功能等相關指標，進行飲食、生活方式干預，以便降低NAFLD患病風險。同時ALDH2基因表達在NAFLD的發病機制中可能扮演著重要角色，有待于進一步深入探索。