蘿卜硫素對肺腺癌A549細胞侵襲遷移的抑制作用及其機制

邵松軍，段玲弟，張湘燕，葉賢偉，饒珊珊，汪國雨，龍運芝

1貴州省人民醫院，貴陽520100；2國家衛生健康委員會肺臟免疫性疾病診治重點實驗室；3合肥市第二人民醫院

非小細胞肺癌（NSCLC）患者占全部肺癌患者的85%以上，生存率比較低［1］。肺腺癌細胞的侵襲遷移是導致患者預后不佳的重要原因，因此深入研究細胞遷移機制以及尋找有效的藥物治療靶點迫在眉睫。Wnt1因子是Wnt家族成員之一，有學者發現在肺癌中Wnt1高表達，并且其可通過介導Wnt/βcatenin信號通路促進肺癌細胞失去上皮極性而獲得間充質表型，進而增強肺癌的侵襲與遠處遷移［2］。前期研究發現，賴氨酸羥化酶3可通過活化Wnt/βcatenin信號通路促使肺腫瘤細胞間質膠原沉積，通過促進上皮間充質轉化促進肺癌細胞的侵襲遷移。以上研究表明Wnt1因子可通過激活Wnt/β-catenin信號通路調控肺癌的侵襲遷移。

蘿卜硫素（SFN）是從花椰菜等十字花科植物中提取的一種異硫氰酸鹽，具有抗氧化、抗癌、降低血糖等功效，有很好的食用價值和藥用價值。近年研究發現，口服SFN可有效預防胃癌、膀胱癌的發生［3-4］，并且通過抑制Akt/mTOR通路，促進腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖［5-6］，但目前關于SFN對肺腺癌的侵襲遷移的作用及機制尚未見報道。2018年10月—2019年12月，我們觀察了SFN對肺腺癌A549細胞侵襲遷移能力的影響，并探討其可能的作用機制，為NSCLC的防治提供新藥物治療靶點和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑、儀器肺腺癌A549細胞（廣州吉尼歐生物科技有限公司）；SFN（Sulforaphane）（美國MCE公司），Wnt1刺激因子（美國PeproTech公司）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），DMEM培養 基（5.5 mmol/L glucose）、胎 牛 血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（澳洲Gibco公司），Anti-Wnt1（英國Abcam公司），Anti-β-catenin（美國Pro‐teintech公司），β-actin、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（武漢普瑞美斯生物有限公司），Transwell細胞小室、Matrigel基質膠（北京優尼康生物科技有限公司）；細胞培養箱（Thermo），酶標檢測儀（Thermo MK3型），搖床（Qilinbeier TS-1000），免疫印跡實驗電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠電泳成像儀（Bio-Rad）。

1.2 肺腺癌A549細胞分組、SFN的加入方法A549細胞加入濃度分別為0、5、10、20、40、80μmol/L的SFN后采用MTT法［6］檢測細胞活性，A549細胞存活 率依次 為100%、90.33%±3.51%、83.33%±4.04%、78.00%±2.65%、41.33 %±7.09%以 及14.00%±5.29%，與SFN 0μmol/L比較，SFN 5、10、20、40、80μmol/L干預后A549細胞活力降低（P均＜0.05）。最終選定20 μmol/L作為本實驗中SFN的濃度。

肺腺癌A549細胞用含10%胎牛血清的高糖培養基培養，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養，對數生長期細胞用于后續實驗。A549細胞分為對照組、模型組及干預組，對照組采用10%FBS培養基培養48 h，模型組10% FBS培養基培養并給予Wnt1 5 μmol/L刺激細胞48 h，干預組采用10% FBS培養基培養并給予Wnt1 5 μmol/L+SFN 20 μmol/L干預細胞48 h。

1.3 各組細胞遷移、侵襲能力檢測①細胞遷移能力采用細胞劃痕實驗檢測。將A549細胞制成5×105/mL的細胞懸液，接種于6孔板中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養12 h，除去培養基，無菌PBS洗1遍，用100 μL移液器槍頭沿6孔板底部垂直畫一條直線，無菌PBS洗2遍，根據分組加相應的藥物，每孔培養基2 mL，置培養箱中繼續培養48 h。用倒置顯微鏡拍攝記錄給藥后0 h、48 h各孔的距離。細胞遷移抑制率=［0 h遷移距離-48 h遷移距離］/0 h遷移距離］［7-8］。②細胞侵襲能力檢測采用Transwell實 驗。Transwell小 室 膜 底 部 用Matrigel稀釋膠包被、水化，把培養基（含20% FBS）加入24孔板內，將Transwell小室置24孔板中，用含5%FBS培養液將各組細胞制備成密度為2×105/mL的細胞懸液，置培養箱培養24 h后取出小室，用甲醛固定后結晶紫染色，PBS漂洗后用棉簽擦去小室內膜上的細胞，在顯微鏡下拍照記錄穿膜細胞數量。

1.4 各組細胞Wnt1和β-catenin蛋白的檢測采用Western blotting法。將A549細胞以4×105/mL接種于6孔板中，給予相應藥物干預48 h后，用PIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉膜，封閉，孵育一抗4℃過夜（一抗稀釋比例：Wnt1 1∶2 000，β-catenin 1∶1 000，βactin 1∶4 000），次日，孵育辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（稀釋比例1∶6 000），1 h后采用ECL化學發光液進行顯影。應用Image Lab軟件分析條帶灰度值并分析。

1.5 統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組A549細胞遷移、侵襲能力比較48 h后，Wnt1刺激細胞后，細胞的遷移能力加強；給予SFN干預后，細胞的遷移能力明顯受到抑制，見圖1。干預組、模型組、對照組細胞遷移數量分別為（35.33±2.52）、（65.00±6.24）、（28.00±2.65）個，與對照組比較，模型組細胞遷移數量增多，與模型組比較，干預組細胞遷移數量少（P均＜0.05）。Transwell侵襲實驗顯示，Wnt1刺激細胞后，細胞的侵襲能力加強；給予SFN干預后，細胞的侵襲能力明顯受到抑制，見圖2。SFN干預組、模型組、正常對照組、Wnt1和 細 胞 侵 襲 數 量 分 別 為（44.67±14.98）、（127.33±11.93）、（31.00±11.14）個，與對照組比較，模型組細胞侵襲數量增多，與模型組比較，干預組細胞侵襲數量減少（P均＜0.05）。

圖1 各組顯微鏡下遷移細胞（×200）

圖2 各組顯微鏡下侵襲細胞（×200）

2.2 各組Wnt1和β-catenin蛋白水平比較與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin蛋白水平升高；與模型組比較，干預組Wnt1、β-catenin蛋白水平降低（P均＜0.05）。各組Wnt1、β-catenin蛋白水平見表1。

表1 各組Wnt1、β-catenin蛋白水平（±s）

表1 各組Wnt1、β-catenin蛋白水平（±s）

組別對照組模型組干預組Wnt1 0.40±0.29 0.76±0.06 0.42±0.11 β-catenin 0.56±0.09 1.06±0.16 0.60±0.14

3 討論

肺癌是我國發病率、病死率最高的惡性腫瘤［9-10］，嚴重影響人們的健康和生存質量，其中NSCLC中肺腺癌侵襲和遷移能力較強。尋找抑制肺腺癌侵襲遷移的靶點有助于為肺腺癌的防治提供思路。Wnt1因子是Wnt家族主要成員之一，有研究發現，Wnt1蛋白在NSCLC中高表達，并且過表達Wnt1蛋白會導致NSCLC細胞增殖、遷移增加［11-12］。

花椰菜提取物SFN具有抗炎抗氧化作用，是抗癌效果最好的植物活性物質［13-14］。SFN可通過調控多種通路促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，降低腫瘤血管生成，抑制其遷移［15-16］；降低腫瘤預后復發率和疾病進展［17］。最新研究發現，SFN可通過調控IL-6/ΔNp63α/Notch通路抑制煙草煙霧導致的肺癌干細胞增殖與浸潤遷移，抑制上皮間充質轉化過程，起到預防和治療肺癌的作用［18］，但其具體調控機制仍不清楚。本研究中，我們通過MTT法篩選出SFN對A549細胞活性的抑制最佳濃度（20μmol/L）。應用Wnt1因子刺激后，采用Western blotting法檢測Wnt1和β-catenin蛋白表達，發現二者表達增加，激活Wnt/β-catenin信號通路轉導，促使A549細胞侵襲遷移，與前期研究結果Wnt/βcatenin通路激活后可促進肺癌上皮間充質轉化，導致肺癌的侵襲與遠處遷移一致。同時，采用SFN干預后，二者表達減少，抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導，從而抑制肺腺癌細胞的侵襲遷移。結合細胞劃痕實驗和Transwell實驗證實SFN對肺腺癌A549細胞侵襲遷移有抑制作用。

綜上所述，SFN對肺腺癌A549細胞侵襲遷移有抑制作用，其機制主要與阻止Wnt/β-catenin信號通路轉導有關，但其具體作用機制有待今后的深入探索。本研究為新型藥物SFN應用于肺癌治療提供研究基礎和參考依據。后續研究我們將把SFN與多種肺癌細胞的增殖、凋亡與細胞周期聯系起來，并通過敲低或過表達Wnt1或β-catenin，深入探討SFN與Wnt/β-catenin信號通路對肺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響。