幾丁質酶抑制劑及噻唑烷酮類化合物合成與農用活性研究進展

張婧瑜, 韓 清, 蔣志洋, 李慧琳, 鄧鳴飛,朱 凱, 李明君, 段紅霞

(中國農業大學 理學院 應用化學系 農藥創新中心，北京 100193)

0 引言

幾丁質酶廣泛存在于昆蟲、真菌和線蟲等多種有害生物體內，具有重要的生理功能和獨特的結構特征。通常，幾丁質酶的異常會引起昆蟲生長發育受阻、化蛹困難以致死亡，或使病菌生長受阻、致病能力下降，或引起線蟲卵無法孵化、導致胚胎死亡。因此，近年來幾丁質酶已經成為重要農藥靶標之一。

一直以來，幾丁質酶及其抑制劑研究受到人們的廣泛關注。隨著幾丁質酶及其抑制劑研究工作的不斷涌現，研究人員分別針對幾丁質、幾丁質酶和幾丁質酶抑制劑進行了不同層次的綜述。其中，Moussian系統闡述了幾丁質結構、化學性質及其在不同生物體內的生物學意義[1]。Zhu等對昆蟲體內的幾丁質代謝過程進行了詳細說明，并對涉及幾丁質代謝的關鍵酶進行了簡要介紹[2]。Adrangi等側重對不同生物幾丁質酶結構和功能特征，以及不同生物幾丁質酶之間的區別和聯系進行了歸納總結[3]。Saguez等概述了幾丁質酶分類、在不同生物中功能、幾丁質酶活性的正或負調節機制，并列舉了糖類和肽類幾丁質酶抑制劑的生物活性及作用機制[4]。Chen等針對多種幾丁質酶所屬的糖苷水解酶18家族 (GH18) ，闡述了GH18酶分類、功能、結構、催化機制以及傳統糖類、肽類抑制劑和近年來發現的新型抑制劑作用機制[5]。同時Chen等進一步聚焦昆蟲幾丁質酶，對已報道的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis和果蠅Drosophila melanogaster幾丁質酶晶體結構進行分析和比較，并從底物類似物、天然產物和虛擬篩選角度對該酶抑制劑的結構和作用機制進行了總結[6]。

本文主要以亞洲玉米螟幾丁質酶結構為代表，在簡單討論幾丁質酶抑制劑結構、活性和結合方式后，重點對表現出幾丁質酶抑制活性的噻唑烷酮類化合物的合成方法及其農用生物活性進行了綜述，以期為進一步開發新型噻唑烷酮類幾丁質酶抑制劑提供參考。

1 幾丁質酶功能和結構特點

幾丁質是一種不存在于植物及高等動物體內，僅存在于昆蟲、真菌和線蟲中的胞外功能性多糖，其化學本質為乙酰葡糖胺線性多聚體，是由β-(1,4) 糖苷鍵連接的多個N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)構成的[1-2]。幾丁質是昆蟲外骨骼及圍食膜、真菌細胞壁和線蟲卵的重要組分，對多種生物起到保護和支撐作用。幾丁質酶是一類糖苷水解酶 (glycosyl hydrolases，GH)，廣泛存在于昆蟲、細菌、真菌、線蟲以及高等動植物體內，參與其生長發育及免疫等多種生理活動。在不同生物體內，幾丁質酶發揮著不同的生理功能，如昆蟲幾丁質酶是昆蟲蛻皮和外表皮重塑過程中的關鍵酶，真菌幾丁質酶與其細胞壁的形成、菌絲的生長有著密切聯系，線蟲幾丁質酶是線蟲卵孵化過程中的關鍵酶，植物和人類幾丁質酶則參與植物防御或人體免疫機制[3]。

最近，Chen等對亞洲玉米螟的多種幾丁質酶結構和功能進行了分析和比較，指出絕大多數昆蟲幾丁質酶都屬于GH18家族，其催化結構域為(α/β)8TIM桶結構，該結構由8個β折疊和8個α螺旋共同組成，其催化三聯體DXDXE位于桶壁，其側鏈則指向桶結構內部；同時，他們對不同類幾丁質酶各自獨有的結構特征進行了詳細闡述[6]。基于此，本文以亞洲玉米螟幾丁質酶 (OfCht)為代表，重點對OfCht共有結構特征和配體結合腔特點進行總結，以期為新型酶抑制劑的發現提供理論指導。目前，晶體結構已經得到解析的亞洲玉米螟幾丁質酶包括OfCht Ⅰ、OfCht Ⅱ、OfChtⅢ、OfChtⅣ和OfChi-h[7]。亞洲玉米螟不同幾丁質酶表現出不同的生理功能，其中OfCht Ⅰ、OfCht Ⅱ和OfChi-h存在于亞洲玉米螟的蛻皮液中，主要與昆蟲蛻皮過程有關；而OfChtⅢ與幾丁質合成相關；OfChtⅣ則存在于昆蟲消化道內，具有防御中腸內真菌感染的作用[6]。

如圖1所示，在不同OfCht與寡糖形成的復合物晶體結構中，其槽狀幾丁質結合腔是OfCht的共同特征，該結合槽被劃分為多個糖基結合位點，以 ?n～+n進行位點位置編號，?n代表非還原端，+n代表還原端，幾丁質糖苷鍵的斷裂就發生在 ?1和 +1位點之間，即催化三聯體DXDXE位于 ?1與 +1位點之間[3,8]。在底物結合槽內部有多個芳香性殘基，以OfCht Ⅰ為例 (圖1A)，其底物結合腔中包含有Trp34、Phe61、Trp107、Trp223、Trp217和Trp372等芳香性殘基，這些殘基可以與底物形成多重π-π堆積作用，對幾丁質酶與底物的結合具有重要意義。同時，不同OfCht為適應其不同的功能特點，其幾丁質結合槽在深度、寬度、位點數量、內部芳香性殘基數目以及分布上又表現出不同的特點。例如：OfCht Ⅰ底物結合腔中共有10個芳香性殘基，其對稱地分布于底物催化位點的兩側[9]；而OfChi-h底物結合腔中共有15個芳香性殘基，其分布表現出高度不對稱性，且與OfCht Ⅰ相比，OfChi-h結合腔更深、更窄[7]。從位點數量上來看，OfCht Ⅰ結合腔包含有 ?3～+2共5個糖基結合位點，而OfChi-h結合腔和OfCht Ⅱ結合腔則各有 ?5～+2和 ?4～+3的7個糖基結合位點[6]。如圖1所示，嵌入結合槽中寡糖的糖鏈走勢和糖環取向可以直觀地反映OfCht底物結合槽特點。在多數OfCht-寡糖復合體中，其結合槽 ?n位點空間較大，而 +n位點則更為狹窄；且底物結合槽中 ?n位點和 +n位點的芳香性殘基側鏈具有明顯取向差異，這使得結合于 +n位點的糖環和結合于 ?n位點的糖環之間也存在著明顯取向差異，如結合于 +1、+2等 +n位點的糖環是“嵌入”結合槽中，而結合于 ?1、?2等 ?n位點的糖環則“平鋪”在結合槽內。這一取向上的差異將會導致 ?1糖環和 +1糖環之間糖苷鍵 (即催化斷裂位點) 的扭轉。

2 幾丁質酶抑制劑

2.1 糖類幾丁質酶抑制劑

糖類幾丁質酶抑制劑作為底物類似物是發展較早的幾丁質酶抑制劑之一。Saguez等和Chen等分別對糖類酶抑制劑的生物活性及其與酶結合方式進行了綜述[4-5]。本文主要概述該類抑制劑的幾丁質酶抑制活性及其與酶結合模式，并對最近報道的糖類幾丁質酶抑制劑殺蟲活性及酶抑制活性等進行介紹。如圖式1所示，糖類幾丁質酶抑制劑主要包括脫乙酰殼多糖 (GlcN)n(2)、阿洛氨菌素 (3)、TMG-(GlcNAc)4(4) 和GlcNAc (β1-4)Glc (5)，這4類抑制劑均與幾丁質酶底物——幾丁質 (1，圖式1) 相似，具有多糖環的結構。

2.1.1 脫乙酰殼多糖 如圖式1所示，脫乙酰殼多糖 (GlcN)n(2) 是β-1,4糖苷鍵連接的葡萄糖胺多聚體，可看作是幾丁質的脫乙酰產物，在結構和來源上均與幾丁質具有共通性。構成 (GlcN)n的GlcN可以與幾丁質酶底物結合槽中每個糖基結合位點一一結合，且與幾丁寡糖中GlcNAc結合方式相似，因此，(GlcN)n是幾丁質酶的競爭性抑制劑。研究表明，(GlcN)n對多種植物病菌和鱗翅目昆蟲均有防效[4]。目前，幾丁質酶與不同 (GlcN)n復合物晶體結構已被陸續報道，包括OfCht Ⅰ -(GlcN)5(PDB: 3WQV)、OfCht Ⅰ -(GlcN)6(PDB:3WQW)[9];OfCht Ⅱ(CAD1)-(GlcN)8(PDB: 6JAX)[11];OfCht Ⅱ(CAD1)-(GlcN)7(PDB: 5Y2B)、OfCht Ⅱ(CAD2-E2180L)-(GlcN)5(PDB: 5Y2C)[13];OfChi-h-(GlcN)7(PDB: 5GQB)[7]等。不同 (GlcN)n對OfCht抑制常數 (Ki) 或半抑制濃度 (IC50) 普遍在10～50 μmol/L之間[9,11,13]，向亞洲玉米螟5齡幼蟲中注射脫乙酰殼多糖 (GlcN)2-7混合物，可造成其發育受阻并導致死亡[9]。

2.1.2 阿洛氨菌素 阿洛氨菌素 (allosamidin，3)是最早發現的幾丁質酶抑制劑，具有廣譜和高效的幾丁質酶抑制活性，對鱗翅目幼蟲具有較高致死作用，并有較弱的殺蚜活性[4,14]。如圖式1所示，阿洛氨菌素具有與幾丁質水解催化反應中間體相似的噁唑啉結構。在OfCht Ⅳ與阿洛氨菌素復合物晶體中 (PDB: 6JMB)，阿洛氨菌素主要結合于亞洲玉米螟幾丁質酶底物結合槽的 ?3～?1位點，其噁唑啉結構可與相應的 ?1位點殘基形成多種相互作用[12](圖2)，這與阿洛氨菌素和煙曲霉幾丁質酶B1 (AfChiB1)[15]、人類幾丁質酶 (HsCht1)[16]結合方式相似。

2.1.3 TMG-(GlcNAc)4如圖式1所示，TMG-(GlcNAc)4(4) 具有與幾丁寡糖類似的多糖環結構，但其末端糖環C2位連接的是三甲基氨基而非乙酰氨基。當向亞洲玉米螟的5齡幼蟲中注射0.2 μg TMG-(GlcNAc)4時，會使得多數幼蟲化蛹異常。當TMG-(GlcNAc)4的濃度為10 μmol/L時，對亞洲玉米螟幾丁質酶h(OfChi-h) 的抑制率可達95%。該研究還指出TMG-(GlcNAc)4可被OfChi-h降解生成TMG-(GlcNAc)1?2，由于該降解產物具有與幾丁寡糖相似的化學結構，推測其可能是真正發揮亞洲玉米螟生長抑制作用的關鍵化合物[7]。本文作者推測，TMG-(GlcNAc)4可能同時結合在OfChi-h中幾丁質結合腔的 ?1與 +1位點進而產生抑制作用。

2.1.4 GlcNAc(β1-4)Glc 如圖式1所示，GlcNAc(β1-4)Glc (5) 是幾丁質二糖的類似物，其保留了幾丁質的β-1,4糖苷鍵結構。當用質量濃度為100 μg/mL和10 μg/mL的化合物5b、5c、5d飼喂桃蚜Myzuspersicae時，可導致其若蟲成活率明顯下降。研究指出，化合物5c是桃蚜外切幾丁質酶和綠色木霉Trychoderma viride外切幾丁質酶的競爭性抑制劑，其酶抑制常數 (Ki) 分別為82和115 μmol/L。同時，化合物5a和5c還被報道是灰色鏈霉菌Streptomyces griseus內切幾丁質酶的非競爭性抑制劑，其Ki分別為68和100 μmol/L。研究表明，GlcNAc(β1-4)Glc分子中的丙基結構與幾丁質酶的作用方式可能與阿洛氨菌素的非糖基部分與酶的作用方式具有一定相似性，而化合物5b和5d與酶的結合受到了磺酸基團阻礙，從而導致其幾丁質酶抑制活性下降[17]。

2.2 肽類幾丁質酶抑制劑

肽類抑制劑是另一類發展較早的幾丁質酶抑制劑，分為環五肽和環二肽兩類。Saguez等[4]和Chen等[5]分別對肽類抑制劑的活性、與酶結合方式及構效關系進行了綜述，本文在此基礎上，對肽類抑制劑的生物活性作簡要介紹 (圖式2)。

肽類幾丁質酶抑制劑中，環五肽類化合物(argifin 7 和 argadin 8) 可結合在煙曲霉幾丁質酶B1(AfChiB1) 幾丁質結合腔內，并與其中的芳香性殘基及催化三聯體形成相互作用[18]；環二肽類化合物 (10a～10e) 對粘質沙雷氏菌幾丁質酶B(SmChiB) 具有較弱的抑制活性，且對釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae細胞分裂和白色念珠菌Candida Albicans進入寄主具有抑制效果[19]。但是，肽類化合物對昆蟲幾丁質酶抑制活性和殺蟲活性仍鮮有報道。有報道指出昆蟲幾丁質酶底物結合槽與細菌、真菌幾丁質酶底物結合腔具有類似的結構特點[3]，如SmChiA與OfChi-h之間序列相似度高達73%[7]，本文作者推測對真菌、細菌幾丁質酶具有抑制活性的肽類化合物可能也具有昆蟲幾丁質酶抑制活性，值得關注。

Psammaplin A (9) 是由二硫鍵連接的兩個溴代色氨酸構成的二肽類化合物，是芽孢桿菌Bacillussp.、鏈霉菌Streptomycessp.、放線菌Actinomycessp.、粘質沙雷氏菌Serratia marcescens等細菌幾丁質酶的弱非競爭性抑制劑。Psammaplin A可與SmChiB活性中心結合。同時，它也是葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea的生長抑制劑，且殺蟲活性具有一定選擇性，其對綠棉鈴蟲Heliothis virescens無殺蟲活性，而對同為鱗翅目害蟲的小菜蛾Plutella xylostella卻具有中等致死活性，對桃蚜和大戟長管蚜Macrosiphum euphorbiae的致死活性較高 (濃度為50 μg/mL時，其致死率為100%)，中毒的大戟長管蚜表現出發育異常、蛻皮不完全等癥狀，這可能與其幾丁質酶異常相關[4,20]。

2.3 新型幾丁質酶抑制劑

近年來，越來越多的幾丁質酶晶體結構得到解析，這使得開發具有新型骨架的幾丁質酶抑制劑成為可能。這些抑制劑的發現或基于高通量虛擬篩選，或以天然產物為導向。基于上述總結的OfCht底物結合槽共同特點，如圖3所示，本文作者推測新型OfCht抑制劑的分子結構通用模型可能是由具有氫鍵特征的柔性橋鏈連接兩側剛性平面結構組成的，其中兩側平面結構可與酶結合槽內的芳香性氨基酸殘基側鏈形成π?π堆積或疏水作用。Chen等[6]對幾丁質酶抑制劑的虛擬篩選過程及結果進行了概述，并對Phlegmacin B1和小檗堿兩類天然幾丁質酶抑制劑的活性和作用方式進行了總結。本文在此基礎上，對虛擬篩選得到的幾丁質酶抑制劑化學結構進行聚類分析，簡要介紹其生物活性及其與幾丁質酶結合方式，并對小檗堿、Phlegmacin B1以及香豆素類化合物3類幾丁質酶抑制劑進行綜述。

2.3.1 由虛擬篩選發現的幾丁質酶抑制劑 在圖式3所示的由虛擬篩選發現的幾丁質酶抑制劑中，TP3(11)、FQ3(12)、化合物17、18均含有由柔性酰胺鍵連接一大一小兩個芳香性的結構特征，化合物13、14共同特點是由酰胺鍵連接剛性平面結構和非平面結構，化合物15、16結構特點同為柔性烷烴鏈連接剛性平面結構和環結構。可見，這些新型幾丁質酶抑制劑結構總體特征與本文作者所提出的OfCht酶抑制劑模型完全或部分相符。

TP3(11)、FQ3(12) 以及化合物13均是OfCht Ⅰ抑制劑。TP類化合物對GH18家族酶具有廣譜抑制活性，且對SmChiB抑制活性最為突出，而對OfCht Ⅰ抑制活性較弱，其中TP3可結合于OfCht Ⅰ的 ?3～ ?1位點，其異丙基的結構可與位于 ?1位點的催化殘基Glu148形成相互作用。而FQ類化合物可特異性地抑制OfCht Ⅰ，其中FQ3活性最優，其半抑制濃度 (IC50) 為6.4 μmol/L，它可同時占據OfCht Ⅰ的 ?n和 +n位點，并與Glu148形成氫鍵[21]。化合物13具有良好的OfCht Ⅰ抑制活性，其Ki為 0.71 μmol/L，可結合于OfCht Ⅰ的 ?3～ ?1位點，與結合腔中多個芳香性殘基形成疏水或堆積作用[22]。

聯吡啶-苯并嘧啶酮類 (14)、哌啶-噻吩吡啶類化合物 (15)、萘二甲酰亞胺類化合物 (16) 是OfCht Ⅱ抑制劑。這3類化合物與OfCht Ⅱ結合方式非常相似：即分子中的疏水結構夾在酶 +1或+2位點的兩個色氨酸之間，同時另一片段結合在?1位點處[6]。可見，化合物14、15、16與OfCht Ⅱ的結合可充分占據OfCht Ⅱ催化位點。

化合物14的衍生物17、18對OfChi-h具有良好抑制活性，其Ki值分別為0.39和9 nmol/L。在OfChi-h與化合物18復合物晶體結構 (PDB：6JMN) 中，該類化合物的并環結構可與幾丁質結合腔中 +1、+2位點的保守色氨酸形成π?π堆積作用，其橋鏈上的酰胺結構則可與酶催化殘基Glu308形成氫鍵，這對該類化合物發揮酶抑制活性具有重要作用[23]。

2.3.2 以天然產物為導向的幾丁質酶抑制劑

2.3.2.1 Phlegmacin B1Phlegmacin B1(圖式4，19) 是籃狀菌屬真菌的次生代謝產物，是OfChi-h和OfCht Ⅰ的競爭性抑制劑。Phlegmacin B1可結合于OfChi-h的 ?3～+1位點，其兩個蒽醌片段與幾丁質結合腔中的Trp160、Trp268、Trp532形成π?π作用，其O2和O9可分別與催化殘基Trp160、Glu308形成氫鍵。向亞洲玉米螟注射或喂食Phlegmacin B1均可導致其蛻皮障礙[24]。

2.3.2.2 小檗堿及其類似物 小檗堿 (20a) 存在于黃連屬植物中，是重要的幾丁質酶競爭性抑制劑。如圖式4所示，小檗堿結構中帶正電荷的異喹啉片段是其發揮幾丁質酶抑制活性的重要功能片段。幾丁質結合腔中保守色氨酸殘基可與小檗堿的異喹啉結構形成π?π堆積作用，其帶負電的酸性氨基酸殘基可與小檗堿形成靜電相互作用。小檗堿對OfCht Ⅰ的Ki為19 μmol/L，其保留了帶正電共軛結構的類似物palmatine(20b)、thalifendine(20c)，對OfCht Ⅰ的Ki均為15 μmol/L；另一類似物四氫化小檗堿 (tetrahytroberberine，20d) 由于不具有平面大共軛結構和表面正電荷，對OfCht Ⅰ不表現抑制活性[25]，這進一步證實了分子中剛性平面結構對于幾丁質酶抑制活性具有重要貢獻。

黃連屬是小檗科中一屬，小檗科植物所含有的藥根堿 (21, jatrorrhizin)、O-甲基南天竹堿 (22,nantenine)、鬼臼毒素 (23, podophyllotoxin) 等化合物均具有與小檗堿相似的結構片段，其中鬼臼毒素類化合物被報道具有中等殺蟲活性，可使中毒的黏蟲Mythimna separata表現出生長發育異常等癥狀，這可能與幾丁質酶活性異常相關[26]。可見，來自于小檗科植物的天然產物可能是昆蟲幾丁質酶抑制劑的重要先導化合物之一。

2.3.2.3 香豆素類化合物 香豆素 (2H-1-苯并吡喃-2-酮) 廣泛存在于多種植物、真菌和細菌中。3-酰胺香豆素類化合物24和25 (圖式4) 可結合于煙曲霉幾丁質酶B1(AfChiB1) 活性中心，其共軛結構可與殘基形成π?π堆積和疏水作用，經測試該類化合物不僅具有較高的幾丁質酶抑制活性(IC50= 4.68～11.7 μmol/L)，而且對白色念珠菌和煙曲霉均具有良好抑制效果 (minimum inhibitory concentration（MIC) = 6.25～25 μg/mL)[27]。由于白色念珠菌幾丁質合成酶與其幾丁質酶都具有淺而長的底物結合槽，推測對幾丁質合成酶具有抑制活性的分子可能也具有幾丁質酶抑制活性。因此Batran 等以幾丁質合成酶抑制劑26為先導，引入亞胺結構，設計合成了化合物27～33，發現化合物27～33可結合于白色念珠菌幾丁質酶、黑曲霉幾丁質酶和尖刀鐮孢菌幾丁質酶的幾丁質結合槽，與周圍殘基形成氫鍵等相互作用，且具有較弱幾丁質酶抑制活性 (IC50= 1.00～15.95 mmol/L)[28]。這一研究結果證明，幾丁質合成酶抑制劑也有望成為幾丁質酶抑制劑的候選分子。

綜上所述，香豆素類化合物可與真菌幾丁質酶的幾丁質結合槽產生良好結合作用，且該類化合物具有真菌幾丁質酶抑制活性。鑒于真菌幾丁質酶和昆蟲幾丁質酶在底物結合槽的結構和催化功能上均具有很高相似性，因此，香豆素類化合物也具有開發成為以昆蟲幾丁質酶為靶標的新型殺蟲劑的潛力。香豆素類化合物具有廣泛的殺蟲和殺螨活性[29]。有研究指出，香豆素類化合物——東莨菪內酯 (34, scopoletin) (如圖式4) 可致使朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus表皮皺縮，且其幾丁質酶很可能是東莨菪內酯的作用靶標[30]。這一研究也進一步表明香豆素類化合物有望成為昆蟲幾丁質酶抑制劑的候選先導之一。

2.3.3 噻唑烷酮類幾丁質酶抑制劑 2-亞胺-噻唑烷-4-酮類化合物 (圖式5) 對亞洲玉米螟N-乙酰己糖胺酶 (OfHex)[31-32]和OfChi-h[32]均具有良好的抑制活性。其中，化合物35、36酶抑制活性最佳，在10 μmol/L時對OfHex抑制率分別為65.8%和81.3%，對OfChi-h抑制率分別為79.6%和59.2%，但未見相關殺蟲活性報道。根據分子對接結果，發現化合物35、36與OfChi-h結合方式具有較大差異，化合物35萘基占據在結合腔中 +1、+2位點，處于Trp268和Trp389之間，其苯氧乙基則占據由Phe184、Thr269和Leu270組成的疏水腔，其環外N原子與催化殘基Glu308間可形成氫鍵作用。而化合物36與OfChi-h分子對接結果中，上述疏水腔則主要由該分子中萘基結構占據。可見，盡管化合物35和36結構具有高度相似性，但它們在OfChi-h結合腔中卻存在著顯著差異，這暗示了結構相似的化合物在幾丁質酶結合腔中可能存在著多種不同結合構象。最近本文作者實驗室設計合成的含胡椒堿骨架硫代噻唑烷酮類化合物37 (圖式5)，對OfCht Ⅰ也表現出較高抑制活性，當濃度為2 μmol/L時，其抑制率達到68.5%，且在200 μg/mL下，化合物37對亞洲玉米螟致死率達到40%；此外，該化合物對小菜蛾、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、黏蟲致死率均超過50%，其對豆蚜Aphis craccivora、朱砂葉螨T. cinnabarinus和尖音庫蚊Culex pipiens幼蟲也具有致死活性[33]。

3 噻唑烷酮類化合物合成及其農用生物活性

噻唑烷酮類化合物具有殺鱗翅目害蟲[34-36]、殺蚊[36]、殺蠅[36]、殺蚜[34,37-38]、殺線蟲[38]和抗真菌[39]等農用活性，殺蟲劑靶標酶中的幾丁質酶[31-32]、酪氨酸酶[40-42]以及殺菌劑靶標酶中琥珀酸脫氫酶[43]均有被報道可作為噻唑烷酮類化合物靶標。同時，噻唑烷酮結構包含多個反應中心，這有利于對其進行多方面結構改造。因此，噻唑烷酮類化合物受到研究人員廣泛關注。

噻唑烷酮類化合物根據結構可進一步分為噻唑烷-4-酮類、噻唑烷-2,4-二酮類和2-硫代噻唑烷-4-酮類3類 (圖式6)，不同噻唑烷酮類化合物在合成方法上具有一定共通性。在噻唑烷酮2、3、5號位連接不同取代基，可極大影響化合物生物活性[44]。本文對噻唑烷酮類化合物的合成方法及其農用生物活性進行了較為全面的總結和展望。

3.1 噻唑烷-4-酮類化合物合成及農用生物活性

3.1.1 噻唑烷-4-酮類化合物合成方法1 以胺、醛和α-巰基乙酸為原料，經席夫堿中間體縮合生成噻唑烷酮類化合物，是合成噻唑烷-4-酮類化合物的常用方法之一 (圖式7)[34-35,37,45]。在該合成方法中，通常使α-巰基乙酸過量，反應完成后可通過水洗除去多余α-巰基乙酸。如圖式7所示，對噻唑烷-4-酮類化合物合成方法進行分析歸納，發現產物噻唑烷酮中3號位N源于原料胺，因此，選用不同取代胺作為原料，可實現產物3號位不同取代。同理，2號位C源于原料醛，選用不同取代醛作為原料可實現產物2號位不同取代；5號位C源于α-巰基乙酸，選用合適的α-巰基乙酸為原料可實現產物5號位不同取代。

實例1：如圖式8所示。胡椒胺38與芳香醛39在無溶劑條件下反應生成中間體席夫堿40，再加入α-巰基乙酸41和溶劑乙醇，回流6 h，生成2,3-二取代的噻唑烷酮類化合物42，產率為74%～98%。該類硫代噻唑烷酮類化合物對人類糖苷水解酶——α-葡萄糖苷酶抑制常數 (Ki) 為8.9～66.5 nmol/L[45]，但尚未見幾丁質酶抑制活性或農用活性報道。

此外，上述合成方法1也可通過微波促成。與傳統加熱相比，微波輻射條件可使反應速率明顯加快，且產率得到提升[39]。

實例2：如圖式9所示。3-取代色酮43與等量酰肼44在酸性條件下反應生成中間體酰腙45，然后45與5倍當量的α-巰基乙酸41在微波輻射條件下加熱至140℃，反應 9 min，目標化合物46可從反應液中析出，過濾并重結晶即可得到目標物純品。化合物46對苜蓿蚜Aphis craccivoraKoch.表現出較弱生長抑制活性[37]。

實例3：如圖式10所示。化合物47～50也可用上述合成方法1獲得。化合物47對雙孢蘑菇Agaricus bisporus酪氨酸酶具有抑制活性，當R1為H且R2為2-酚羥基苯基時，其酶活性最優，IC50為0.61 μmol/L[42]。化合物48對棉鈴蟲幼蟲具有弱觸殺和胃毒活性[35]。化合物49對二斑葉螨Tetranychus urticae具有中等殺蟲活性，其對斜紋夜蛾Spodoptera litura幼蟲也表現中等至優的胃毒和觸殺活性[34]。化合物50對秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans和食菌莖線蟲Ditylenchus myceliophagus具有較弱毒殺作用[46]。

3.1.2 噻唑烷-4-酮類化合物合成方法2 取代硫脲與α-鹵代酸在堿催化下發生環化反應生成噻唑烷-4-酮，是合成2-亞胺噻唑烷-4-酮類化合物的常用方法 (圖式11)[31-32,43]。產物2-亞胺噻唑烷-4-酮可進一步與芳香醛反應，實現5號位芳烯基取代。

實例1：如圖式12所示。以二氯甲烷為溶劑，在室溫條件下，2-胺基-6-甲基吡啶51與異硫氰酸類化合物52反應，生成不對稱取代的硫脲53。在醋酸鈉催化下，取代硫脲53與氯代乙酸54發生環化反應生成2-亞胺噻唑烷-4-酮類化合物55。化合物55進一步與芳香醛39發生縮合，生成目標產物56。另外，取代硫脲53、芳香醛39和氯代乙酸54在醋酸鈉催化下發生三組分縮合也可生成目標產物56。該類化合物對黃曲霉Aspergillus flavus、黑曲霉Aspergillus niger、赭曲霉Aspergillus ochraceus、茄鏈格孢Alternaria solani、馬鈴薯葉枯病菌Macrophomina phaseoli均具有較高抑制活性，當R為Br、Ar為靛紅 (isatine)或茚三酮 (ninhydrine) 基團時，其半抑制濃度(IC50) 均小于10 μg/mL。同時，分子對接研究證明，該類化合物可與琥珀酸脫氫酶 (PDB：1ZOY)活性中心較好地結合，具有抑制琥珀酸脫氫酶潛力，但尚未見其相關酶抑制活性報道[43]。

該合成方法中α-鹵代酸可替換為α-鹵代酸酯。實例2如圖式13所示。氨基硫脲57與芳香醛39反應生成化合物58。化合物58與α-溴代乙酸乙酯59在堿催化下反應生成2-亞胺肼噻唑烷-4-酮類化合物60。化合物60可進一步與氯代物在堿性條件下反應，生成化合物61。該類化合物對亞洲玉米螟N-乙酰己糖胺酶 (OfHex) 和幾丁質酶h(OfChi-h) 均具有抑制活性[31-32]。

將上述合成噻唑烷-4-酮類化合物的兩種方法進行分析和比較，發現與方法1相比，方法2最大優點為可直接得到2號位為亞胺取代的噻唑烷-4-酮類化合物。因此，在合成2-亞胺噻唑烷-4-酮類化合物時，方法2為優選方法；而若要得到3號位取代 (N上取代) 噻唑烷酮類化合物時，則選擇方法1更為直接。

3.2 2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物合成及農用生物活性

3.2.1 2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物合成方法1 如圖式14所示。胺與二硫化碳在堿性條件下反應生成二硫代氨基甲酸類化合物，二硫代氨基甲酸類化合物與α-鹵代酸依次在堿性和酸性條件下發生連續兩步反應，生成2-硫代噻唑烷-4-酮 (繞丹寧，rhodanine) 類化合物。對2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物合成方法進行分析和總結 (圖式14)，發現產物硫代噻唑烷酮類化合物3號位取代基來自于原料胺，因此，要獲得3號位連有特定取代基產物，則應選用特定取代胺作為原料。同理，產物5號位的碳原子源自原料鹵代酸α-C，選用相應取代α-鹵代酸可實現產物噻唑烷酮5號位取代。

實例1：如圖式15所示。4-氯苯胺62依次與二硫化碳63、α-溴代酸 (鈉鹽形式) 64在0 ℃下反應，經酸化后生成繞丹寧類化合物65。產物以沉淀形式出現，室溫下過濾所得濾渣，并在冰醋酸中重結晶即可得到目標物65，產率約為70%。化合物63對家蠅Musca domestica、甘藍蚜Brevicoryne brassicae和二斑葉螨T. urticae具有殺蟲活性，且對根結線蟲具有明顯防效[38]。

該合成方法是3號位取代的繞丹寧類化合物的經典合成方法，反應可在水溶液中進行，且后處理簡單。化合物66 (圖式16) 也可用類似方法合成，其對埃及伊蚊Aedes aegypti幼蟲具有較高致死活性[47]。

2-硫代噻唑烷-4-酮具有典型的氫鍵受體結構特征，且其環狀結構以接近平面狀態存在，這種獨特的結構特征很可能是2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物具有多重生物活性的原因。本文作者前期研究發現，2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物具有優異的OfCht Ⅰ抑制活性[33]，推測可能是由于幾丁質酶催化位點周圍存在多個氫鍵特征殘基，且底物結合槽中有多個芳香性殘基，使得含有氫鍵受體和近平面結構特征的2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物可以通過與幾丁質酶催化中心結合，抑制其發揮催化活性。同時，繞丹寧類化合物含有碳硫雙鍵結構，可以與人類碳酸酐酶Ⅰ(hCAⅠ) 中金屬離子配位[48]。有研究報道指出，繞丹寧類化合物對含銅離子酶——雙孢蘑菇A. bisporus酪氨酸酶具有抑制活性[49]，其原因可能也是繞丹寧類化合物中的碳硫雙鍵結構與酪氨酸酶活性中心銅離子配位結合，進而發揮其酪氨酸酶抑制活性。

3.2.2 2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物合成方法2 如圖式17所示，N-取代異硫氰酸類化合物與巰基乙酸發生環化反應，可生成相應的3-取代-2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物，這是另一種2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物的常用合成方法。用該方法合成繞丹寧類化合物，在合適條件下可避免副反應發生。

實例1：如圖式18所示。4-胺基苯磺酰胺67與二氯硫化碳68在酸催化下反應生成異硫氰酸類化合物69，化合物69與巰基乙酸41在堿催化下反應生成2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物70。產物以沉淀形式出現，反應液冷卻后抽濾并對濾渣進行重結晶即可得到產物純品[48-50]。

Knoevenagel縮合反應是實現2-硫代噻唑烷-4-酮5號位修飾的常用方法之一。如圖式19所示，2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物70的5號位可通過不同縮合反應進行多種修飾。化合物70a與四氰基乙烯71反應，生成5-二氰基甲烯基硫代噻唑烷酮類化合物72；與N,N-二甲基甲酰胺二甲縮醛(DMF-DMA)反應生成5-N,N-二甲基氨基乙烯基硫代噻唑烷酮類化合物73；與原甲酸三乙酯74縮合生成5-氧乙烯基硫代噻唑烷酮類化合物75；與芳香醛縮合生成5-取代苯甲烯基硫代噻唑烷酮類化合物76、77。研究指出，化合物72～77對赭曲霉A. ochraceus、產黃青霉Penicillium chrysogenum具有較弱生長抑制活性[50]。

對比上述兩種2-硫代噻唑烷-4-酮類化合物合成方法，發現實際上二者具有共通性。兩種方法均以含氨基化合物為初始原料，氨基N為硫代噻唑烷酮環上N原子來源，最終得到相應的3-取代硫代噻唑烷酮類化合物。所以，從實現3號位取代來考慮，選擇上述兩種方法中任一種均可，在后續研究中可以依據原料性質差異進行合理選擇。

3.3 噻唑烷-2,4-二酮合成及農用生物活性展望

硫脲與α-氯代乙酸在水中反應可生成2-亞胺噻唑烷-4-酮，隨后2-亞胺噻唑烷-4-酮在酸性條件下發生水解，生成噻唑烷-2,4-酮類化合物。該方法常用于噻唑烷-2,4-二酮類化合物合成[51-52]。目標化合物噻唑烷-2,4-二酮5號位的碳原子源于氯代乙酸α-C，因而以不同α-氯代酸為原料即可得到相應的5-取代噻唑烷-2,4-二酮類化合物。如圖式20所示。

該方法應用實例如圖式21所示，α-氯代乙酸54與硫脲78反應，在較低溫度下得到2-亞胺噻唑烷-4-酮中間體，該步反應耗時較短；然后酸化反應液，使中間體在水溶液回流溫度下發生水解，生成目標物噻唑烷-2,4-二酮79。噻唑烷-2,4-二酮類化合物79可與3,4,5-三甲氧基苯甲醛80在酸堿共同催化下發生Knoevenagel縮合反應，生成5-取代苯甲烯基噻唑烷-2,4-二酮類化合物81，若將噻唑烷-2,4-二酮轉化為雙酰胺鹽類物質82，再進一步與α-鹵代酰基化合物83或氯代乙腈84反應，則可生成相應的3-取代噻唑烷-2,4-二酮類化合物85(圖式21)。研究指出，化合物85、86可抑制人類乳腺癌細胞增長[51]，但尚未見其相關農用活性報道。

該方法以水為溶劑，反應液冷卻后即可析出產物，經過濾、重結晶即可得到噻唑烷二酮類化合物。該方法原料易得，且反應可得到無取代噻唑烷-2,4-二酮骨架結構，便于進一步進行結構修飾。目前尚未見有關噻唑烷-2,4-二酮類化合物農用殺蟲或殺菌活性的報道，但該類化合物與繞丹寧類化合物是生物電子等排體，具有極為相似的結構特征，因此，本文作者推測噻唑烷-2,4-二酮類化合物也可能具有繞丹寧類化合物的生物活性，如表現出一定的幾丁質酶或酪氨酸酶等抑制活性，有待進一步研究確證。

4 小結與展望

幾丁質酶廣泛存在于昆蟲、真菌和線蟲等多種有害生物體內，具有重要生理功能和獨特結構特征，是重要農藥作用靶標之一。糖類和肽類化合物是較早研究發現的幾丁質酶抑制劑，但目前這兩類幾丁質酶抑制劑數量仍然較少，且結構較為單一。近年來，有關幾丁質酶結構生物學研究取得巨大進展，尤其是亞洲玉米螟的多個幾丁質酶晶體結構陸續被報道，這為基于害蟲幾丁質酶結構篩選和發現結構多樣的幾丁質酶新型抑制劑奠定了生物學基礎。近年來被報道的幾丁質酶抑制劑大多是通過虛擬篩選或以天然產物為先導發現的，其中部分化合物具有優異幾丁質酶抑制活性，但其殺蟲活性尚有待探究和提高。噻唑烷酮類化合物因其具有多種藥用活性而受到廣泛關注，但目前報道該類化合物大多涉及其醫用活性，有關農用活性報道相對較少。最近本課題組研究發現，硫代噻唑烷酮類化合物不但具有優異幾丁質酶抑制活性，還對多種農業害蟲表現出優良殺蟲活性。因此，本文針對噻唑烷-4-酮、2-硫代噻唑烷-4-酮和噻唑烷-2,4-二酮3類化合物結構進行剖析，并對現有常用合成方法進行總結，期望為新型噻唑烷酮類幾丁質酶抑制劑研究和開發奠定基礎。

槽狀幾丁質結合腔和結合腔中分布有多個芳香性氨基酸側鏈是幾丁質酶共同特征，底物與幾丁質酶可形成多重π-π堆積作用。基于已篩選獲得的酶抑制劑及其與幾丁質酶結合模式，本文作者提出：幾丁質酶新型抑制劑結構特點可能具有由柔性片段連接兩個剛性平面結構特征，其中，剛性平面結構可與芳香性氨基酸側鏈形成π?π或疏水相互作用。此外，不同物種幾丁質酶幾丁質結合腔在其深度、寬度、位點數量、內部芳香性殘基數目及分布上表現出不同特點，這為基于非靶標生物幾丁質酶和有害生物幾丁質酶結構差異，設計和開發出具有優良選擇性的幾丁質酶抑制劑提供了參考。