不同劑量促排卵藥物對小鼠焦慮行為和生育力的影響

馮穎 王芊芊 王沖 程兆俊 周文靜 章道會 費小陽

在輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology,ART）周期中促排卵藥物的使用實質(zhì)上是對患者添加外源性激素。而性激素水平的改變與各時期女性的焦慮、抑郁狀態(tài)息息相關(guān)[1-2]。研究表明，焦慮狀態(tài)可以降低施行ART患者的獲卵數(shù)、正常受精率、優(yōu)胚率、妊娠率和胚胎種植率[3-4]。然而，目前關(guān)于促排卵藥物引起患者焦慮行為及對生育力的影響研究少見。本研究擬通過促排卵C7BL/6J近交系小鼠，模擬機體外源性接受超排卵藥物狀態(tài)，并通過高架十字迷宮（elevated plus maze,EPM）實驗，利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾沖突來評估動物的焦慮行為[5-6]；再進行體外受精實驗，進一步分析不同劑量促排卵藥物對小鼠卵母細胞及胚胎質(zhì)量的影響，以期為ART周期中制定合理劑量的促排卵方案，減輕患者經(jīng)濟負擔和精神壓力，改善生育結(jié)局提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡SPF級C57BL/6J雌鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，按照SFP級標準飼養(yǎng)于浙江大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)浙江大學(xué)動物福利倫理審查委員會批準開展（ZJU20200135）。

1.1.2 主要儀器與試劑 本實驗所用儀器為EPM，Any-maze動物行為分析系統(tǒng)6.0（美國Stoelting公司），體式解剖鏡（日本Olympus公司，型號：SZ61），相差顯微鏡（日本Nikon公司，型號：SM2645）等。所用試劑為注射用孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）（麗珠集團麗珠制藥廠，5000 U/瓶）、絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（麗珠集團麗珠制藥廠，5000 U/瓶）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠轉(zhuǎn)棒實驗 48只4周齡的C57BL/6J雌鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每天撫觸適應(yīng)環(huán)境，進行編號。用Panlab小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞測試儀（美國Harvard Apparatus公司，型號：LE8205）對每只小鼠進行檢測，設(shè)置轉(zhuǎn)速為20 r/min，時間為 5 min。觀察小鼠在轉(zhuǎn)棒上的運動，以此評估小鼠運動能力。

1.2.2 小鼠EPM實驗 將小鼠逐只放入EPM測試箱中，實驗人員在距離測試箱1 m處觀察記錄下述指標：（1）進入開臂次數(shù)；（2）開臂滯留時間；（3）進入閉臂次數(shù)；（4）閉臂滯留時間。每只小鼠測試5 min。將48只小鼠按隨機數(shù)字表法分成4組（5、7.5、10、15 U劑量組），每組12只。促排卵前1 d下午4:00，4組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2 ml，30 min后，進行EPM實驗，記錄數(shù)據(jù)；促排卵當天下午4:00，4組小鼠分別腹腔注射5、7.5、10、15 U的PMSG 0.2 ml[7]（將PMSG加入0.9%氯化鈉溶液稀釋配用），48 h后注射相同劑量的hCG（將hCG加入0.9%氯化鈉溶液稀釋配用），30 min后進行EPM實驗，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 小鼠體外受精實驗

1.2.3.1 卵母細胞采集 4組小鼠注射hCG 15 h后采用頸椎脫臼法處死，剖腹取出輸卵管放入盛有配子準備液（modified human tubal fluid medium，mHTF）的表面皿中，顯微鏡下放入礦物油中，找到輸卵管膨大部，用解剖針稍刺破膨大部，將卵母細胞團引出，并導(dǎo)入到mHTF培養(yǎng)滴（取卵前1 d，用直徑35 mm的培養(yǎng)皿做好，石蠟油覆蓋，放入37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h）。

1.2.3.2 精子采集 取交配過的性成熟C57BL/6J雄鼠1只，頸椎脫臼法處死，剪下附睪的上體部，用注射針刺破，擠出精子團放入mHTF培養(yǎng)滴中，CO2培養(yǎng)箱中放置1 h再行體外受精。

1.2.3.3 體外受精 將培養(yǎng)1 h的精子懸浮液在鏡下檢查精子活力和精子數(shù)量，然后用移液器按每個培養(yǎng)滴10μl精子懸浮液移入卵母細胞滴（每只小鼠卵母細胞單獨放 1滴），將精子終濃度調(diào)至（2～4）×106個/ml，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后取出，用移卵管將受精卵移入新的mHTF培養(yǎng)滴中清洗兩次，放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.3.4 早期胚胎的形態(tài)學(xué)評價 培養(yǎng)24 h后的受精卵做鏡檢，統(tǒng)計胚胎數(shù)、未受精卵及異常卵數(shù)。其中，正常胚胎和未受精卵形態(tài)正常，具有完整的透明帶，不含空泡和碎片，細胞質(zhì)明亮均一。未受精卵細胞不分裂。死亡卵顏色發(fā)暗并帶有細胞質(zhì)顆粒；細胞質(zhì)內(nèi)含有碎片、部分細胞質(zhì)溶解的卵為畸形卵；死亡卵和畸形卵都屬于異常卵[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，組內(nèi)促排卵前后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠運動能力評估 適應(yīng)性飼養(yǎng)期間小鼠體格正常、毛色光亮、行為活動正常。轉(zhuǎn)棒實驗顯示本實驗小鼠運動能力均無異常。

2.2 EPM實驗結(jié)果

2.2.1 總體活動情況 4組小鼠促排卵前、后總進臂（進入開臂+進入閉臂）次數(shù)比較見表1。

表1 4組小鼠促排卵前、后總進臂次數(shù)比較（次）

由表1可見，組內(nèi)比較，4組小鼠促排卵后總進臂次數(shù)均較促排卵前減少（均P＜0.05）。組間比較，促排卵前4組小鼠總進臂次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；促排卵后，15 U劑量組小鼠總進臂次數(shù)明顯少于5 U劑量組、7.5 U劑量組（均P＜0.05）。即促排卵會引起小鼠焦慮行為，且劑量越高，焦慮行為越明顯。

2.2.2 開臂活動情況 4組小鼠促排卵前、后進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間比較見表2。

由表2可見，組內(nèi)比較，4組小鼠促排卵后進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間均較促排卵前減少（均P＜0.05）。組間比較，促排卵前4組小鼠進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；促排卵后，10 U、15 U劑量組小鼠進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間均明顯少于5 U劑量組、7.5 U劑量組（均P＜0.05）。

表2 4組小鼠促排卵前、后進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間比較

2.2.3 閉臂活動情況 4組小鼠促排卵前、后進入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時間比較見表3。

由表3可見，組內(nèi)比較，7.5 U劑量組、15 U劑量組小鼠促排卵后進入閉臂次數(shù)均較促排卵前減少（均P＜0.05），10U劑量組小鼠促排卵后閉臂滯留時間較促排卵前增加（P＜0.05）。組間比較，促排卵前4組小鼠進入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；促排卵后，10 U劑量組小鼠閉臂滯留時間明顯長于5 U劑量組、7.5 U劑量組（均P＜0.05）。

表3 4組小鼠促排卵前、后進入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時間比較

2.3 4組小鼠體外受精結(jié)果比較 見表4。

由表4可見，4組小鼠平均卵母細胞數(shù)、異常卵率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），10 U劑量組卵母細胞數(shù)高于5 U劑量組、7.5 U劑量組、15 U劑量組（均P＜0.05），且異常卵率較5 U劑量組和7.5 U劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。15 U劑量組卵母細胞數(shù)明顯低于其他3組（均P＜0.05），且異常卵率最高，明顯高于其他3組（均P＜0.05）。這表明10 U劑量可以獲得最多的卵母細胞，且不增加異常卵率，更高劑量的促排藥物反而會抑制卵泡的發(fā)育。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，10 U劑量組的受精率明顯高于5 U劑量組（P＜0.05），10 U劑量組的體外受精平均胚胎數(shù)也最高，明顯高于其他3組（均P＜0.05），而15 U劑量組平均胚胎數(shù)最低，明顯低于其他3組（均P＜0.05）。這表明10 U劑量可以獲得最多的胚胎。

表4 4組小鼠體外受精結(jié)果比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)促排卵藥物刺激會使小鼠產(chǎn)生焦慮行為，同時過量的促排卵藥物對卵子質(zhì)量也有影響。宗紹波等[9]指出，EPM中總進臂次數(shù)、進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間的復(fù)測性度較高，更能體現(xiàn)實驗動物趨近-規(guī)避沖突的行為結(jié)果，是評價動物焦慮表現(xiàn)的主要指標。因此，本研究重點分析了以上數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)最低5 U劑量組和最高15 U劑量組小鼠的總進臂次數(shù)、進入開臂次數(shù)和開臂滯留時間均存在統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，促排卵藥物會使小鼠會產(chǎn)生焦慮行為，而且隨著劑量的增加，小鼠焦慮行為更甚。其他研究者也發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J雌鼠雌激素水平的改變會影響小鼠的焦慮狀態(tài)[10]；而在老年的C57BL/6J雌鼠中添加雌激素可以改善小鼠的焦慮及抑郁狀態(tài)[11]。

PMSG/hCG和雌激素均可以在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此本研究通過體外受精實驗，研究了促排卵藥物對小鼠生育力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組小鼠平均卵母細胞數(shù)和平均胚胎數(shù)存在統(tǒng)計學(xué)差異。其中，10 U劑量組平均卵母細胞數(shù)、平均胚胎數(shù)均顯著高于其他3組，可能為C57BL/6J小鼠最佳超排劑量。而增加促排卵藥物劑量至15 U后，小鼠平均卵母細胞數(shù)和平均胚胎數(shù)均下降。此外，不同劑量促排卵后小鼠異常卵率也存在差異；其中，15 U劑量組小鼠異形卵率最高。因此筆者推測，隨著促排卵藥物劑量的增加，小鼠卵細胞的質(zhì)量明顯下降，異常卵數(shù)和異常卵裂率均上升。Ertzeid等[12]也提出，卵巢刺激會損害小鼠卵母細胞/胚胎質(zhì)量以及子宮環(huán)境，因此筆者提倡使用較小劑量的PMSG/hCG對小鼠進行促數(shù)排卵。

綜上所述，PMSG/hCG促排卵藥物會使小鼠產(chǎn)生焦慮行為，并且隨著促排卵藥物劑量的增加焦慮行為也更明顯；此外，高劑量的促排卵藥物會降低卵細胞的質(zhì)量，增加異常卵的風險。本研究為ART中促排卵藥物對患者情緒的影響提供了實驗室依據(jù)，也為制定合理劑量的促排卵方案提供參考。