青藤堿對Heymann腎炎大鼠足細胞損傷的干預作用及機制研究

林宜 孫玥 譚建平 朱斌 高源成 殷佳珍 王文榮 陳洪宇

膜性腎病是機體產生針對腎小球足細胞的自身抗體，并在局部形成免疫復合物損傷足細胞而導致的慢性腎小球疾病，以腎小球基底膜上皮細胞下免疫復合物沉積伴基底膜彌漫性增厚為病理特征[1]。青藤堿為中藥青風藤的主要單體生物堿，具有明顯抗炎、免疫抑制等藥理作用[2-7]。臨床研究證實青藤堿治療慢性腎小球腎炎及IgA腎病患者有效，且不良反應少[8-9]，但其對治療慢性腎小球疾病的作用機制尚未完全明確。本研究旨在觀察青藤堿對Heymann腎炎大鼠足細胞損傷的干預作用，探討其可能的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗大鼠 體重120～140 g健康雄性SD大鼠100只，由浙江省中醫研究院提供[動物許可證號：SYXK（浙）2014-0003]。

1.1.2 主要藥物、試劑和儀器 雷米普利片（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，5 mg/片）。青藤堿注射液（湖南正清制藥集團股份有限公司，每支50 mg/2 ml）。羊抗大鼠Fx1A血清（美國Probetex有限公司，批號：PTX-002S）。GTVision Ⅲ抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒[基因科技（上海）有限公司，批號：GK500705]。抗nephrin抗體-C-terminal[艾博抗（中國香港）貿易有限公司]。抗podocin抗體[艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：ab50339]。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗大鼠IgG[密理博（上海）貿易有限公司，批號：AP189F]。10%中性福爾馬林（北京益利精細化學品有限公司）。純度＞99%戊巴比妥鈉（杭州達成生物有限公司）。PBS磷酸鹽緩沖液（福州邁新生物技術開發有限公司）。加強型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。100×檸檬酸組織抗原修復液（福州邁新生物技術開發有限公司）。羊動物非免疫血清（福州邁新生物技術開發有限公司，批號：SPKIT-B2）。病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器有限公司）。BMJ-Ⅲ型包埋機（常州中威電子儀器有限公司）。BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺（常州中威電子儀器有限公司）。DNP-9082型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）。電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。STIATOS臺式低溫高速冷凍離心機（德國賀利氏控股公司）。日立7180全自動生化分析儀（株式會社日立制作所）。RM2235輪轉切片機[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司]。CM1950冷凍切片機[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司]。BX51生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]。-20℃普通低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。微波爐（格蘭仕集團）。代謝籠（浙江省中醫研究院自制）。

1.2 方法

1.2.1 被動型Heymann腎炎（passive Heymann nephritis,PHN）大鼠模型制備 大鼠適應性喂養1周，選取24 h尿蛋白定量＜10 mg的健康大鼠為實驗對象。禁食給水12 h，按隨機數字表法隨機分為對照組15只，PHN大鼠模型制作組85只。制作PHN大鼠模型：大鼠尾靜脈注射0.4 ml/100 g體重羊抗大鼠Fx1A血清（臨用前室溫融化，4℃ 3 000 r/min離心5 min，棄沉淀），30 s內緩慢注入。對照組僅尾靜脈注射0.4 ml/100 g體重0.9%氯化鈉注射液。大鼠造模1周后留取24 h尿液，檢測24 h蛋白定量＞10 mg視為造模成功。

1.2.2 實驗分組和給藥方法 對造模成功的PHN大鼠，按不同給藥方案分為5組：青藤堿低、中、高劑量組（青藤堿干預組），雷米普利組，模型組，每組17只。造模后第9天開始，對青藤堿低、中、高劑量組分別按20、40、60 mg/（kg·d）體重腹腔注射青藤堿注射液1次。雷米普利組按5 mg/（kg·d）體重給予雷米普利混懸液（現用現配，研缽充分研磨，再加入0.9%氯化鈉注射液配置成0.5 mg/ml的混懸液）灌胃1次。模型組和對照組按雷米普利組等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃1次。定期稱重，根據體重調整給藥量。給藥第10、20天，每組分別處死5只大鼠，給藥第30天處死剩余大鼠。

1.2.3 標本采集 應用代謝籠，留取造模后第7天，給藥后第10、20、30天大鼠的24 h尿液以測定尿蛋白濃度。測給藥后第10、20、30天大鼠體重，腹腔注射0.45%戊巴比妥鈉溶液1 ml/100 g體重進行麻醉。血液標本采集：剖腹暴露腹主動脈，腹主動脈采血1 ml至含EDTA真空采血管，輕輕搖勻，采2 ml血液至普通真空采血管。腎組織標本采集：切取雙腎，剝離包膜，迅速切取長3 mm、寬3 mm、厚1.5 mm腎臟皮質組織2塊，浸泡于含0.9%氯化鈉溶液的離心管中，置于冷藏箱，以備免疫熒光檢查；切取長3 mm、寬2 mm、厚1.5 mm腎臟皮質組織2塊，浸泡于含3.75%戊二醛的離心管中，置于冷藏箱，以備電鏡檢查；余組織浸泡于10%甲醛溶液中，以備光鏡及免疫組織化學檢查。

1.2.4 生化指標測定 （1）24 h尿蛋白檢測采用全自動生化分析儀；（2）血清ALT、AST、血肌酐、白蛋白測定采用全自動生化分析儀；（3）血白細胞測定采用全自動血細胞分析儀。

1.2.5 腎臟病理指標檢測 取經10%中性甲醛溶液固定后的腎臟皮質組織，常規脫水，石蠟包埋，制成2.5μm切片，行HE、過碘雪夫酸（PAS）、過碘酸六胺銀（PASM）染色，光鏡下觀察并攝片。取經3.75%戊二醛及2%鋨酸雙固定后的腎臟皮質組織，丙酮梯度脫水，包埋后切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，水洗后電鏡下觀察。處死大鼠當天，將浸泡于0.9%氯化鈉溶液中的2塊腎臟皮質組織進行冷凍切片。切片后水洗，在組織上滴加FITC標記的羊抗大鼠 IgG 50 μl/片（1∶100稀釋），將切片置于濕盒中，放于37℃恒溫培養箱45 min。取出片子，水洗后熒光顯微鏡下攝片進行腎臟組織免疫熒光IgG的檢測；取各組經10%中性甲醛溶液固定后的腎臟皮質組織，常規脫水，石蠟包埋，制成 2μm切片，67℃恒溫烤箱固定24 h，防止脫片，而后進行免疫組化步驟，脫蠟至水，檸檬酸組織抗原修復液高火3 min，再將組織片快速放入，解凍15 min，自然冷卻。3%雙氧水，滅活內源性過氧化物酶，常溫10 min。滴加山羊血清、滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素復染10 min，水洗，乙醇脫水、干片、封片，行podocin、nephrin免疫組化檢測。用萊卡病理圖像采集系統采集圖像。免疫組化、免疫熒光檢查每個標本選取5個視野，采用image pro plus6.0軟件進行分析，得到PHN大鼠腎小球內IgG、podocin和nephrin的陽性區平均積分光密度。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較 給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠24 h尿蛋白水平均高于對照組（均P＜0.05）；給藥第10天，青藤堿高劑量組低于模型組（P＜0.05）；給藥第20天，青藤堿中、高劑量組均低于模型組（均P＜0.05）；給藥第30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組間比較均無統計學差異（均P＞0.05）。大鼠24 h尿蛋白水平整體呈青藤堿干預組＜雷米普利組＜模型組的趨勢，青藤堿高劑量組＜青藤堿中劑量組＜青藤堿低劑量組的趨勢。見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較（mg/24 h）

2.2 各組大鼠血清白蛋白水平比較 給藥第10天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠血清白蛋白水平均低于對照組（均P＜0.05），而與模型組比較無統計學差異（均P＞0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較均無統計學差異（均P＞0.05）。給藥第20天，模型組、青藤堿中劑量組均低于對照組（均P＜0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與模型組比較均無統計學差異（均P＞0.05），且青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較均無統計學差異（均P＞0.05）。給藥第30天，模型組低于對照組（P＜0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與對照組、模型組比較均無統計學差異（均P＞0.05），青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較亦無統計學差異（均P＞0.05）。血漿白蛋白水平整體呈對照組＞青藤堿干預組＞雷米普利組＞模型組的趨勢。見表2。

表2 各組大鼠血清白蛋白水平比較（g/L）

2.3 各組大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比較 給藥第10、20、30天，各組大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比較均無統計學差異（均 P＞0.05），見表 3～6。

表3 各組大鼠血清肌酐水平比較（μmol/L）

表4 各組大鼠血WBC水平比較（×109/L）

表5 各組大鼠血清ALT水平比較（U/L）

表6 各組大鼠血清AST水平比較（U/L）

2.4 模型組與對照組大鼠腎臟組織病理學變化比較 對照組大鼠腎臟組織病理切片光鏡下未見明顯異常。模型組大鼠腎臟組織病理切片光鏡下見腎小球結構清晰，毛細血管襻開放較好，系膜細胞及系膜基質未見明顯增生，可見腎小球基底膜增厚伴釘突形成，基底膜空泡變性。見圖1-3（插頁）。模型組大鼠腎臟組織行電鏡下觀察見造模第30天后，大鼠腎臟組織可見較多散在的大小不等的電子致密物在腎小球基底膜內、上皮細胞下沉積，基底膜不均勻增厚，釘突形成，足細胞足突廣泛融合。見圖4。

圖1 模型組與對照組大鼠腎臟組織HE染色病理學變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖2 模型組與對照組大鼠腎臟組織過碘雪夫酸（PAS）染色病理學變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖3 模型組與對照組大鼠腎臟組織過碘酸六胺銀（PASM）染色病理學變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖4 模型組大鼠造模第30天后腎臟組織電鏡下病理學變化所見（×5 000）

2.5 各組大鼠腎臟組織IgG沉積情況比較 對照組大鼠腎臟組織免疫熒光檢查示無IgG沉積。青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟免疫熒光檢查均可見IgG沿腎小球毛細血管襻呈彌漫、顆粒狀沉積，且給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟組織免疫熒光IgG陽性區平均積分光密度比較無統計學差異（P＞0.05）。見表7。

表7 各組大鼠腎臟免疫熒光IgG陽性區平均積分光密度比較

2.6 各組大鼠腎臟組織podocin蛋白表達情況比較 各組大鼠腎臟組織免疫組化檢查均可見podocin蛋白沿腎小球毛細血管襻表達。給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟組織免疫組化podocin陽性區平均積分光密度均低于對照組（均P＜0.05），而青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較無統計學差異（均P＞0.05）；給藥第20天，青藤堿高劑量組高于模型組（P＜0.05）。podocin陽性區平均積分光密度整體呈對照組＞青藤堿治療組＞雷米普利組＞模型組的趨勢。見表8。

表8 各組大鼠腎臟組織蛋白podocin免疫組化陽性區平均積分光密度

2.7 各組大鼠腎臟組織nephrin蛋白表達情況比較 各組腎臟免疫組化檢查均可見nephrin沿腎小球毛細血管襻表達。免疫組化nephrin陽性區平均積分光密度的統計分析：給藥第10天，模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組低于對照組（P＜0.05）；各治療組與模型組之間無統計學差異（P＞0.05）；各青藤堿治療組之間亦無統計學意義（P＞0.05）。給藥第20天，模型組、青藤堿低劑量組低于對照組（P＜0.05），青藤堿高劑量組高于模型組（P＜0.05），各青藤堿治療組之間亦無統計學意義（P＞0.05）。給藥第30天，各組之間均無統計學差異（P＞0.05）。各組nephrin陽性區平均積分光密度整體呈對照組＞青藤堿干預組＞雷米普利組＞模型組的趨勢。見表9。

表9 各組大鼠腎臟組織蛋白nephrin免疫組化陽性區平均積分光密度比較

3 討論

中老年膜性腎病使用常規西藥糖皮質激素及細胞毒藥物等治療不良反應較為常見，而中醫藥治療膜性腎病有較好效果。中藥青風藤自古用于風濕病的治療，具有抗炎、免疫抑制作用[2，10]。青藤堿為青風藤的主要單體生物堿，研究發現其具有抗炎及免疫抑制作用[11-18]，具有腎臟保護作用[19-29]。

本研究通過尾靜脈注射羊抗大鼠Fx1A血清，成功建立PHN模型。結果表明，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠24 h尿蛋白水平均高于對照組；給藥第10天，青藤堿高劑量組24 h尿蛋白水平低于模型組；給藥第20天，青藤堿中、高劑量組24 h尿蛋白水平均低于模型組。24 h尿蛋白水平整體呈青藤堿干預組＜雷米普利組＜模型組的趨勢，青藤堿高劑量組＜青藤堿中劑量組＜青藤堿低劑量組的趨勢。與之相應，隨著24 h尿蛋白水平下降，血漿白蛋白水平上升，可見青藤堿可減少Heymann大鼠尿蛋白排泄。

膜性腎病的尿蛋白主要與自身足細胞抗原介導的足細胞損傷有關，免疫病理學檢查顯示上皮下免疫復合物沉積。本研究觀察腎臟組織IgG沉積，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與模型組之間，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組之間腎臟組織IgG沉積情況無統計學差異，由此可見，青藤堿并未減少局部免疫復合物沉積。既往研究表明青藤堿可上調阿霉素誘導的大鼠腎臟足細胞nephrin和podocin表達[30]。由此，筆者推測青藤堿也可能通過干預Heymann大鼠足細胞蛋白分子的表達起到保護作用。免疫組化檢測podocin表達，顯示青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠腎臟組織podocin陽性區平均積分光密度顯著低于對照組；給藥第20天，青藤堿高劑量組高于模型組。各組podocin陽性區平均積分光密度整體呈對照組＞青藤堿干預組＞雷米普利組＞模型組的趨勢。nephrin的表達結果表明，給藥第10天，模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組顯著低于對照組；給藥第20天，模型組、青藤堿低劑量組顯著低于對照組，青藤堿高劑量組顯著高于模型組，各組nephrin陽性區平均積分光密度整體呈對照組＞青藤堿干預組＞雷米普利組＞模型組的趨勢。由于足細胞中podocin、nephrin分子是組成足細胞足突裂孔隔膜的縫隙蛋白，是構成腎小球濾過屏障重要組成部分，這些裂孔膜蛋白的缺失或者突變會導致尿蛋白。由此可見，青藤堿可能通過上調PHN大鼠腎臟組織podocin、nephrin的表達，修復足細胞損傷，減少尿蛋白排泄。

此外，本研究中所用青藤堿劑量在治療PHN大鼠過程中無明顯肝腎功能、骨髓的影響。在觀察青藤堿療效的同時，對其神經系統改變進行觀察。青藤堿治療組大鼠腹腔注射后較其他組大鼠表現出短暫性行動遲緩，推測與青藤堿的鎮靜作用有關，未見抽搐等神經系統不良反應；可見本研究中腹腔注射青藤堿劑量對PHN大鼠無神經系統損傷。

綜上所述，本研究結果顯示青藤堿可通過上調PHN大鼠腎臟組織podocin、nephrin的表達，修復足細胞損傷以減少PHN大鼠尿蛋白排泄，且其干預作用具有劑量依賴效應，即劑量越大，干預尿蛋白的效果越明顯，且本研究中并未見到明顯的不良反應。