葛根素對腎透明細胞癌786-O細胞生長抑制作用的研究

楊智勇 王曉英 陳永革 周莎莎 魏亞超 李晶 郭志遠 祁衛華

腎細胞癌是起源于腎實質的泌尿系統常見惡性腫瘤之一，全球每年新發病例超過40萬，發病率約占惡性腫瘤的2%[1]。腎透明細胞癌是腎細胞癌的主要病理類型，占發病總數的80%以上。由于其早期無癥狀且缺乏特異性診斷標志物，30%的患者確診時已處于腫瘤中晚期[2-3]。目前，手術切除輔助放化療是臨床治療腎透明細胞癌的首選方案，但化療藥物不良反應廣泛且易產生耐藥性，是術后腫瘤復發轉移的重要原因之一[4]。

中醫藥基于辯證論治方法，具有整體調理、標本兼治、不良反應小的優點，在腫瘤治療方面逐漸得到關注與認可。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，化學結構屬于異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等多種生物學活性[5-6]。研究發現，葛根素能夠抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，對非小細胞肺癌[6]、結腸癌[7]、乳腺癌[8]等具有一定治療作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信號通路對細胞增殖與凋亡具有關鍵性的調控作用[7-8]。本研究通過觀察葛根素對腎透明細胞癌786-O細胞增殖與凋亡的影響，探討其抑制786-O細胞生長的作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞 人腎透明細胞癌786-O細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要藥物與試劑 葛根素購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥99%，批號：B21028）；5-氟尿嘧啶購自美國 Selleck公司（純度≥99.97%，批號：S1209）；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司（批號：1951038）；胰蛋白酶消化液、鏈青霉素雙抗、FBS購自上海源葉生物科技有限公司（批號：20191213、20190930、20200128）；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、增強化學發光（enhanced chemiluminescence,ELC）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號：CA1210、SW2030）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司（批號：201911016、202001005、201912011）；細胞周期和細胞凋亡相關蛋白第10號染色體缺失的磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K,p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白激酶抑制因子p27、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體和山羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司（批號：bsm-52369R、bs-10276R、bs-5570R、bs-6951R、bs-0876R、bs-0623R、bs-0742R、bs-0081R、bs-0294P）。

1.3 主要儀器 BB15型細胞培養箱為德國Heraeus公司產品；iMark型酶標儀為美國BIO-RAD公司產品；CyFlow Counter型流式細胞儀為德國Partec公司產品；SE300型電泳儀、TE22型轉膜儀為美國Hoefer公司產品；5427R型低溫高速離心機為德國Eppendrof公司產品。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養、分組與給藥 人腎透明細胞癌786-O細胞株復蘇后接種于含有10% FBS的RPMI 1640培養基，置于5%二氧化碳、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱中，每2 d更換1次培養基，待細胞覆蓋率約80%時進行傳代。取對數生長期786-O細胞分別給予DMSO（空白對照組）、終濃度10、20、40 mg/L的葛根素溶液[9]（分別為葛根素10、20、40 mg/L組）和 70 mg/L的5-氟尿嘧啶溶液[10]（5-氟尿嘧啶組）干預。

1.4.2 CCK-8法檢測細胞增殖率 各組細胞分別給藥干預6、12、24、48 h，經0.25%胰酶消化和重懸后制備濃度1×104個/ml單細胞懸液，100μl/孔接種于96孔培養板，每組設10個復孔，10μl/孔加入濃度10%的CCK-8溶液，繼續培養2 h后收集細胞，通過酶標儀檢測450 nm處吸光度值（A）。細胞增殖率（%）=（A藥物組/A空白對照組）×100%

1.4.3 細胞克隆實驗檢測細胞克隆形成能力 各組細胞分別給藥干預48 h后更換不含藥的常規培養基，每3 d更換1次培養基，14 d后棄培養基，PBS溶液浸洗細胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，1 ml/孔加入0.5%結晶紫染液染色30 min，吸去染液并晾干后，顯微鏡下觀察并計數細胞。

1.4.4 流式細胞術檢測細胞周期分布 各組細胞分別給藥干預48 h后用0.25%胰蛋白酶消化，離心取細胞，75%乙醇溶液固定12 h，經PBS溶液洗滌后滴加PI溶液避光孵育30 min，通過流式細胞儀檢測488 nm處PI熒光，分析G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分比。

1.4.5 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 各組細胞分別給藥干預48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化，經PBS溶液洗滌后按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明進行處理，通過流式細胞儀分析細胞凋亡水平。

1.4.6 Western blot法檢測細胞周期和細胞凋亡相關蛋白表達水平 各組細胞分別給藥干預48 h后用0.25%胰酶消化，離心取細胞、冰上裂解30 min后4℃、12 000 r/min離心15 min取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，95℃水浴10 min使蛋白變性，行SDS-PAGE電泳分離蛋白、濕轉法轉PVDF膜、麗春紅溶液染色、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，洗膜后滴加目標蛋白抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加ECL顯色，以β-actin為內參，通過條帶灰度值計算目標蛋白相對表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腎透明細胞癌786-O細胞增殖率比較 隨著葛根素10、20、40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預時間的延長，786-O細胞增殖率逐漸降低。干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組與5-氟尿嘧啶組786-O細胞增殖率明顯降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L組786-O細胞增殖率明顯低于5-氟尿嘧啶組（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 各組腎透明細胞癌786-O細胞增殖率比較（a為干預6、12、24、48 h細胞增殖率變化；b為干預48 h細胞增殖率比較；與空白對照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△△P＜0.01）

2.2 各組腎透明細胞癌786-O細胞克隆形成能力比較干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細胞克隆數目明顯降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L組786-O細胞克隆數目明顯低于 5-氟尿嘧啶組（P＜0.01）。見圖 2（插頁）、3。

圖2 各組腎透明細胞癌786-O細胞克隆顯微鏡下所見（a為空白對照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組；結晶紫染液染色，×100倍）

圖3 各組腎透明細胞癌786-O細胞克隆形成能力比較（與空白對照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△△P＜0.01）

2.3 各組腎透明細胞癌786-O細胞周期分布比較 干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組G0/G1期細胞百分比升高，S期細胞百分比降低（均P＜0.01），G2/M期細胞百分比比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組G0/G1期細胞百分比明顯升高且S期細胞百分比明顯降低（P＜0.05或0.01），G2/M期細胞百分比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組腎透明細胞癌786-O細胞周期分布比較（與空白對照組比較，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

2.4 各組腎透明細胞癌786-O細胞凋亡率比較 干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素 10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細胞凋亡率均升高（均P＜0.01），其中葛根素40 mg/L組786-O細胞凋亡率明顯低于5-氟尿嘧啶組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組腎透明細胞癌786-O細胞凋亡率比較（與空白對照組比較，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05）

2.5 各組腎透明細胞癌786-O細胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達水平比較 干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細胞PTEN表達水平上調，p-PI3K、p-Akt蛋白表達下調（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05或0.01）；且與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組PTEN表達水平上調，p-PI3K、p-Akt表達水平下調（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05）。見圖6-8。

圖6 各組腎透明細胞癌786-O細胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達電泳圖（PTEN為第10號染色體缺失的磷酸酶；PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt為蛋白激酶B；p-Akt為磷酸化蛋白激酶B；a為空白對照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組）

圖7 各組腎透明細胞癌786-O細胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達水平比較（PTEN為第10號染色體缺失的磷酸酶；PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt為蛋白激酶B；p-Akt為磷酸化蛋白激酶B；與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖8 各組腎透明細胞癌786-O細胞PI3K、Akt蛋白磷酸化比率比較（a為PI3K蛋白磷酸化比率比較；b為Akt蛋白磷酸化比率比較；與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05）

2.6 各組腎透明細胞癌786-O細胞cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較 干預48 h后，與空白對照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細胞cyclin D1表達水平下調，p27、Cleaved Caspase-3表達水平上調（均P＜0.01）；與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組Cleaved Caspase-3、p27表達水平明顯上調且cyclin D1表達水平明顯下調（均 P＜0.05或 0.01）。見圖 9、10。

圖9 各組腎透明細胞癌 786-O細胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達電泳圖（cyclin D1為細胞周期蛋白D1；p27為周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3為激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；a為空白對照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組）

圖10 各組腎透明細胞癌786-O細胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較（cyclin D1為細胞周期蛋白D1；p27為周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3為激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；與空白對照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

3 討論

細胞增殖失控與凋亡受阻是腫瘤細胞異常生長的重要因素，所以抑制細胞增殖和促進細胞凋亡是腫瘤治療的重要途徑。近年來，隨著振興中醫藥發展戰略的實施，中藥抗腫瘤得到普遍關注，應用逐漸廣泛。葛根是以豆科植物野葛的干燥根入藥，是一味長期應用于臨床的中藥，收入《中國藥典》。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，目前臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療，近年來葛根素抗腫瘤活性得到廣泛關注。本研究以人腎透明細胞癌786-O細胞為受試細胞，并以臨床治療腎透明細胞癌一線化療藥物5-氟尿嘧啶作為陽性對照藥物開展研究，結果顯示經葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預能夠顯著降低786-O細胞增殖率和細胞克隆數目，提高786-O細胞凋亡率，并且葛根素40 mg/L組效果優于5-氟尿嘧啶組，說明葛根素具有抑制人腎透明細胞癌786-O細胞增殖并促進其凋亡的作用。

細胞周期正常運轉是細胞增殖的基礎，一個完整的細胞周期分為G0/G1期、S期、G2/M期三個階段。徐楗熒等[11]研究發現通過抑制G1期-S期轉換能夠阻止細胞有絲分裂而阻滯細胞周期，可作為抗腫瘤藥物的靶點。有多種蛋白參與細胞周期的運轉過程，其中cyclin D1主要在G1期表達，能夠通過刺激腺病毒E2啟動子結合的轉錄因子表達與釋放，進而驅動G1期到S期運轉。Zheng等[12]研究發現cyclin D1過度表達能夠縮短細胞周期，是導致細胞增殖失控引發癌變的重要因素。周期蛋白激酶抑制因子p27能夠與cyclin D1結合而抑制其活性，對細胞周期表現為負性調控作用[13]。本研究結果顯示，經葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預能夠明顯下調786-O細胞cyclin D1表達并上調p27表達，并且葛根素40 mg/L組效果優于5-氟尿嘧啶組，這可能是葛根素抑制786-O細胞增殖的重要分子機制。

細胞凋亡是由多種信號通路和蛋白參與調控的復雜過程，Cleaved Caspase-3參與細胞凋亡的啟動及全過程的調控，在細胞凋亡過程中發揮重要調節作用[14]。腫瘤細胞異常快速增殖過程中導致局部缺氧，病理性刺激線粒體膜通道異常開放導致細胞色素C過度釋放，細胞色素C能夠誘導Caspase-3轉化為Cleaved Caspase-3而被激活[15]。本研究結果顯示，經葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預能夠顯著上調786-O細胞Cleaved Caspase-3表達，并且葛根素40 mg/L組效果優于5-氟尿嘧啶70 mg/L組，這可能是葛根素促進786-O細胞凋亡的重要分子機制。

Akt為PI3K的下游基因，p-PI3K能夠誘導Akt磷酸化（p-Akt）而被活化，PI3K/Akt通路在細胞增殖與凋亡過程中具有重要調控作用[16]。PTEN是一種抑癌基因，能夠抑制PI3K磷酸化而抑制其活化，所以PTEN具有抑制PI3K/Akt信號通路的作用[17]。既往研究發現p-Akt具有誘導Caspase-3活化并上調Cyclin D1表達、下調p27表達的作用[18]。本研究結果顯示，經葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預能夠顯著上調786-O細胞PTEN表達并下調p-PI3K、p-Akt表達，降低PI3K、Akt磷酸化比率，并且葛根素40 mg/L組效果優于5-氟尿嘧啶70 mg/L組，提示葛根素具有上調PTEN表達而抑制PI3K/Akt通路的作用。

綜上所述，葛根素能夠通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡而抑制腎透明細胞癌786-O細胞生長，可能與誘導PTEN表達而抑制PI3K/Akt通路有關。