不同規格鹿茸飲片的多指標質量等級評價△

郭曉晗，程顯隆，柳溫曦，李明華，魏鋒，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

鹿茸是傳統名貴的動物藥，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版一部鹿茸片項下只規定其炮制方法為“取鹿茸，燎去茸毛，刮凈，以布帶纏繞茸體，自鋸口面小孔灌入熱白酒，并不斷添酒，至潤透或灌酒稍蒸，橫切薄片，壓平，干燥”[1]，對鹿茸片的規格無明確的劃分。實際上，市場上的鹿茸片常分為蠟片、粉片、砂片、血片和骨片等[2-4]?！吨腥A人民共和國農業部行業標準》NY/T1162—2006[5]雖對鹿茸片的規格進行了劃分，但農業農村部標準理化測定指標較少，只對不同規格等級鹿茸片的總氨基酸和鈣的含量進行規定。鹿茸飲片質量等級標準不完善，導致難以對鹿茸產品進行有效的質量控制和評價，市場中出現的易混品、劣品與偽品[6-8]，更給市場監管帶來挑戰。面對鹿茸片質量等級混亂問題，根據其傳統應用及化學成分特點，建立多指標的綜合質量評價體系顯得尤為重要。

近年來，學者們對鹿茸的化學成分的一系列研究表明，其成分復雜多樣，主要成分是蛋白質和氨基酸，還包括激素、脂類、多糖、多胺、生物堿等多種化學成分[9-11]，其中蛋白質是鹿茸質量控制的重要指標[12-13]。同時，研究表明，鹿茸中化學成分隨生長周期不同呈規律的變化[14-16]，與這些指標相關的檢測項目，包括總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸等，這些指標與鹿茸的質量密切相關；并且隨著其生長年限的增加，鹿茸會逐漸骨化，鈣的含量發生變化。因此，本研究根據《中國藥典》2015年版中的檢測指標設定慣例，對鹿茸蠟片、粉片、血片和骨片的總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸等進行測定，以期結合多指標定量分析為不同商品規格的鹿茸飲片的質量評價和等級劃分提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；Binder FED-115型熱循環干燥箱(賓德公司)；KjeltecTM2400型自動凱式定氮儀(瑞典福斯公司)；AE240型電子天平(Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

乙腈為色譜純(英國Thermo Fisher公司)；氨基酸(含量測定用)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院：絲氨酸(純度：99.9%)、甘氨酸(純度：100.0%)、組氨酸(純度：99.9%)、精氨酸(純度：99.9%)、蘇氨酸(純度：99.9%)、丙氨酸(純度：99.9%)、脯氨酸(純度：99.9%)、酪氨酸(純度：99.8%)、纈氨酸(純度：99.9%)、甲硫氨酸(純度：99.9%)、異亮氨酸(純度：99.9%)、亮氨酸(純度：99.9%)、苯丙氨酸(純度：100.0%)、賴氨酸(純度：100.0%)，批號均為140624-201506；羥脯氨酸(批號：111578-201602，純度：99.9%)；異硫氰酸苯酯(Urchem公司，純度：98.0%)；三乙胺、正己烷、無水醋酸鈉、冰乙酸、無水乙醇為分析純，鹽酸為優級純，硫酸銨(批號：20170110)、氫氧化鈉(批號：20170323)、硫酸鉀(批號：20161215)、無水硫酸銅(批號：20170105)、硼酸(批號：20170228)、甲基紅(批號：20161020)、溴甲酚綠(批號：20160330)、無水乙醇(批號：20160729)、硫酸(批號：20170321)、碳酸氫銨(批號：20131028)均購自國藥集團化學試劑有限公司；0.05 mol·L-1硫酸滴定液(中國食品藥品檢定研究院，批號：539906-170405)；水為自制純水。

54批不同規格的鹿茸飲片購買自11家飲片公司(表1)，由中國食品藥品檢定研究院魏鋒研究員鑒定為正品，其中4種代表性規格飲片見圖1。

表1 鹿茸樣品信息

注：A.蠟片；B.粉片；C.血片；D.骨片。圖1 4種規格代表性鹿茸飲片

2 方法與結果

2.1 灰分測定

不同規格鹿茸飲片隨生長周期的變化，其骨化部分也呈現較為規律的變化，因此，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2302)灰分測定法，對收集到的不同規格的鹿茸飲片的灰分進行測定，從而確定其灰分的變化規律。

2.2 浸出物含量測定

2.2.1冷浸法 取鹿茸供試品粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻。取供試品約2 g，精密稱定，以稀乙醇為提取溶劑，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2201)浸出物測定法項下的冷浸法進行測定。

2.2.2熱浸法 取鹿茸供試品粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻。取供試品約2 g，精密稱定，以稀乙醇為提取溶劑，參照《中國藥典》2015年版四部(通則2201) 浸出物測定法項下的熱浸法進行測定。

2.3 總氮含量測定

以定氮儀法測定不同規格鹿茸飲片的總氮含量[參照《中國藥典》2015年版四部(通則0704)氮測定法中第三法]。

2.3.1反應溶液 堿液(40%的氫氧化鈉溶液)；吸收液(每升的1%硼酸溶液加0.1%甲基紅乙醇7 mL與0.1%溴甲酚綠乙醇10 mL)。

2.3.2供試品溶液 取供試品粉末約0.3 g，精密稱定于消化管中，依次加入硫酸鉀(5 g)、無水硫酸銅(0.5 g)、硫酸(10 mL)，置于消化儀中，消解至溶液呈澄清透明的藍綠色之后，再繼續消化20 min，取出，冷卻，備用。

2.3.3空白溶液 將未加供試品粉末的消化管，按2.3.2項下方法消解。

2.3.4測定方法 樣品測定開始前，用空白溶液測定，以便扣除空白值；然后將按照2.3.2項下方法將消解好的供試品溶液置于凱氏定氮儀中，設定好加入試劑的量(堿液50 mL、吸收液50 mL、水60 mL)及其他儀器參數，進行蒸餾和滴定。并且要不斷測定硫酸銨化學試劑的含氮量，作為儀器校準使用。

2.3.5線性關系考察 分別精密量取硫酸銨溶液(26.435 2 mg·mL-1)0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL置于25 mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，分別轉移至消化管中，按照上述方法依次制備和測定。將硫酸銨溶液取樣體積(X)對含氮量滴定結果(Y)進行線性回歸，結果表明，取樣含氮量為2.76～56.07 mg時，具有較好的線性相關性，線性方程：Y=5.610 3X-0.043 7(r=1.000 0)。

2.3.6精密度試驗 精密配制硫酸銨溶液(12.817 mg·mL-1)于消化管中，分別加入硫酸銨溶液10 mL及硫酸10 mL，按照上述方法連續測定6次。硫酸銨溶液的6次含氮量結果基本一致，平均值為21.15%，RSD為0.05%(n=6)，表明精密度良好。

2.3.7重復性試驗 精密稱定同一供試品(批號：LP-1)粉末0.3 g(n=6)于消化管中，按照上述方法依次測定。結果含氮量分別為9.31%、9.30%、9.26%、9.26%、9.33%、9.33%，平均值為9.30%，RSD為0.54%(n=6)，表明實驗重復性良好。

2.3.8加樣回收試驗 分別精密稱定供試品粉末(含氮量為9.30%)6份于消化管中，每份約0.15 g，按照上述方法依次測定含氮量，計算加樣回收率，結果分別為98.49%、99.40%、103.36%、98.84%、100.88%、103.30%，平均回收率為100.71%，RSD為2.71%(n=6)，結果表明準確度良好。

2.4 氨基酸成分的含量測定

鹿茸中氨基酸成分通過柱前衍生化技術，使用高效液相色譜法進行含量測定。空白溶液、混合對照品溶液及供試品溶液的制備參考相關文獻[17]。系統適用性考察結果顯示，15種氨基酸的分離度(R)和理論塔板數均符合要求，高效液相色譜圖見圖2。15種氨基酸線性方程相關系數均大于0.999 4，平均回收率為96.9%～103.2%，RSD均小于3.0%；精密度、穩定性及重復性結果均符合規定，相應的RSD均小于3.0%。分別取50批不同規格的鹿茸飲片粉末各0.20 g，精密稱定，按參考文獻[17]中的方法進行水解和衍生，利用標準曲線法分別計算15種氨基酸的含量及15種氨基酸的總量。

注：A.供試品；B.混合對照品溶液；C.空白溶液；1.羥脯氨酸；2.絲氨酸；3.甘氨酸；4.組氨酸；5.精氨酸；6.蘇氨酸；7.丙氨酸；8.脯氨酸；9.酪氨酸；10.纈氨酸；11.甲硫氨酸；12.異亮氨酸；13.亮氨酸；14.苯丙氨酸；15.賴氨酸。圖2 鹿茸供試品、混合對照品溶液和空白溶液的高效液相色譜圖

3 結果

3.1 不同規格鹿茸飲片的總灰分、浸出物的含量測定

取其中40批鹿茸飲片進行總灰分檢測，測定結果見表1。蠟片：3.5%～4.2%，平均總灰分為3.76%；粉片：31.9%～37.7%，平均總灰分為35.68%；血片：26.3%～37.4%，平均總灰分為31.23%；骨片：37.2%～46.6%，平均總灰分為43.83%。4種鹿茸飲片規格中，蠟片總灰分最低，骨片最高，具有明顯差異；血片和粉片的總灰分有所交叉，不易區別。

以稀乙醇為提取溶劑，對鹿茸飲片分別進行冷浸和熱浸，浸出物的含量測定結果見表2。冷浸條件下，蠟片：13.4%～14.5%；粉片：6.5%～7.9%；血片：5.7%～6.5%；骨片：1.6%～3.1%。熱浸條件下，蠟片：19.8%～22.9%；粉片：9.2%～12.5%；血片：8.0%～9.0%；骨片：4.0%～5.8%。鹿茸飲片隨著骨化程度的加重，醇溶性浸出物呈降低趨勢，依次為蠟片>粉片>血片>骨片。

表2 不同規格鹿茸飲片的總灰分、浸出物的含量測定 %

3.2 不同規格鹿茸飲片的總氮含量測定

取其中46批鹿茸飲片進行總氮測定，其質量分數為6.79%～14.03%。其中蠟片總氮含量(12.25%～14.03%)最高，平均質量分數為13.52%；粉片(9.31%～10.51%)和血片(9.29%～9.97%)兩者總氮含量相差不大，平均質量分數分別為9.65%和9.77%；骨片總氮含量最低(6.79%～7.09%)，平均質量分數為6.95%，結果見表3。

表3 不同規格鹿茸飲片的總氮含量測定 %

3.3 不同規格鹿茸飲片的氨基酸含量測定

50批不同規格鹿茸飲片氨基酸的含量測定結果顯示，15種氨基酸的總量為29.53%～54.09%。其中甘氨酸含量最高，約占6.43%～10.44%，脯氨酸、丙氨酸和精氨酸次之。蠟片(44.56%～54.09%)平均質量分數為49.84%；粉片(40.00%～45.33%)平均質量分數為41.31%；血片(32.88%～39.96%)平均質量分數為38.10%；骨片(29.53%～33.95%)平均質量分數為31.45%。由上述比較分析可知，鹿茸飲片隨著骨化程度的加重，氨基酸平均含量呈降低趨勢，與浸出物變化趨勢保持一致，呈現蠟片>粉片>血片>骨片的趨勢。

3.4 指紋圖譜分析

利用Chem.Pattern軟件對4種規格鹿茸飲片的氨基酸HPLC圖譜進行處理，對圖譜的保留時間進行校正，指紋圖譜圖結果見圖3。經Chem Pattern軟件相似度評價系統對HPLC指紋圖譜相似度分析，50批不同規格的鹿茸飲片指紋圖譜中檢測到15個共有峰，4種商品規格的鹿茸飲片的相似度均大于0.985，說明以氨基酸為分析指標，4種規格的鹿茸飲片具有較高的均一性。

注：A.蠟片；B.粉片；C.血片；D.骨片。圖3 鹿茸蠟片、粉片、血片、骨片高效液相色譜指紋圖譜

3.5 鹿茸飲片質量分級量表

根據上述不同商品規格鹿茸飲片的總灰分、稀乙醇浸出物、總氮、氨基酸含量，進行分析比較，最終，將鹿茸蠟片定為一等品；粉片與血片的各含量測定指標均有所交叉，無法較為明確區分，因此將兩者歸為一類，定為二等品；骨片定為三等品，結果見表4。

表4 鹿茸飲片質量分級

4 討論

4.1 實驗條件的優化與注意事項

浸出物含量測定時，由于鹿茸飲片的主要成分是蛋白質，在浸出物過濾時要使用干燥濾器趁熱盡快過濾，否則溶液會變黏稠甚至凝固，導致浸出物含量測定結果偏低。由于不同的人員在操作時實驗操作上的差別，容易出現測定結果重復性較差的情況。因此，本實驗采用抽濾裝置迅速抽濾并用稀乙醇清洗濾器，最后定容。

氨基酸的含量測定采用柱前衍生化法，可使衍生化與高效液相色譜分離系統相隔離，防止彼此干擾。衍生化試劑選擇異硫氰酸苯酯(PITC)，衍生化產物單一穩定、靈敏度高；同時，為保證衍生化反應完全，所加PITC需過量；最后加入正己烷進行萃取，防止衍生化試劑色譜峰的干擾，避免色譜柱柱效的降低。通過對色譜柱的考察，最終確定使用Agilent TC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，使得異亮氨酸和亮氨酸的色譜峰得到較好的分離。此外，考慮到羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，特意考慮對其進行考察。

4.2 不同規格鹿茸飲片質量等級評價

本研究通過對鹿茸蠟片、粉片、血片、骨片的總灰分、醇溶性浸出物、總氮、氨基酸的含量測定結果進行分析比較，其總灰分呈升高趨勢，其中蠟片平均總灰分含量最高，骨片平均總灰分含量最低，粉片和血片兩者總灰分相差不大。冷浸及熱浸條件下的醇溶性浸出物、總氮含量、氨基酸含量均呈現蠟片>粉片>血片>骨片的降低趨勢，其中粉片和血片兩者各指標含量相差不大，有所交叉。綜上，鹿茸血片與粉片無法明顯區分，這與兩者被切割的部位比較接近有關，且不同的廠家與產地的炮制工藝有所不同，因此，部分鹿茸粉片和血片的相應指標含量會有所交叉。因此，如表4所示，在對鹿茸飲片性狀的初步判斷的基礎上，根據鹿茸飲片的多指標含量測定結果，將鹿茸飲片依次劃分為鹿茸蠟片(一等品)、粉片與血片(二等品)、骨片(三等品)3個等級，由此可在一定程度上規范鹿茸飲片等級混亂、以次充好的現象。

根據鹿茸飲片的化學成分及傳統使用特點，鹿茸飲片的指紋圖譜及多指標的含量測定可以較全面地對其進行質量評價，從而將不同商品規格的鹿茸飲片進行質量等級劃分，這不僅可以規范鹿茸飲片市場，維護消費者的利益，更是對中藥材及飲片質量等級評價新模式的有益嘗試和探索[18]。