基于中藥液、固體物料指標(biāo)成分含量相關(guān)性的膜工藝評估方法創(chuàng)新研究
——以杜仲葉水提液為例

鐘文蔚 ，鄭東陽 ，鄒洪薈 ，卓澤偉 ，郭立瑋

1.廣州中國科學(xué)院先進(jìn)技術(shù)研究所 中藥與天然產(chǎn)物研發(fā)部，廣東 廣州 511458

2.廣州南沙資訊科技園有限公司博士后科研工作站，廣東 廣州 511458

3.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 511436

4.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 524023

5.南京中醫(yī)藥大學(xué) 植物藥深加工工程研究中心，江蘇 南京 210023

6.中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣東 廣州 510240

杜仲葉是杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥葉，具有降血壓、調(diào)血脂、降血糖、抗炎、抗病毒、抗疲勞、強(qiáng)筋健骨、抗衰老的功效。近年來，隨著綠色制造觀念在各行各業(yè)的大力推廣，杜仲葉提取物作為大健康產(chǎn)品，如綠色食品與飼料添加劑的應(yīng)用研究日益廣泛。文獻(xiàn)報道杜仲葉的水提取、精制過程，大多采用醇沉的工藝。近年來，膜集成工藝替代水醇法，已成為中藥水提液澄清、精制工序的重要升級換代技術(shù)，有力地促進(jìn)了中藥綠色制造的進(jìn)程[1-6]。

但如何將不同孔徑的膜進(jìn)行優(yōu)化組合，以及各級膜截留液的“頂洗”（在超濾過程中加入純?nèi)軇1]，通常為水，以增加總滲透量，帶走殘留在截留液里的目標(biāo)成分，達(dá)到提高回收率的目的）程序設(shè)計(jì)合理性，仍要由多次“試錯”才能決定，其主要評估因素是精制過程最終產(chǎn)物干浸膏（固含物）中的中藥指標(biāo)成分含量[7]。能否通過對膜過程液態(tài)物料中間體指標(biāo)性成分的含量檢測結(jié)果，推測、判斷其最終產(chǎn)物干浸膏（固含物）的指標(biāo)性成分含量，從而確認(rèn)膜工藝流程設(shè)計(jì)的科學(xué)與合理性，成為中藥澄清精制膜工藝流程設(shè)計(jì)的技術(shù)瓶頸。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過探索液體物料與其干浸膏（固含物）中指標(biāo)性成分的相關(guān)性模型，為膜澄清工藝過程液體物料中間體提供估算最終固體成品成分含量方法，建立以膜工藝過程液體物料中間體指標(biāo)性成分含量直接評估膜澄清、精制工藝優(yōu)化與否的創(chuàng)新模式，為實(shí)現(xiàn)中藥膜過程智能控制提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

200 nm 陶瓷膜（ZrO2），江蘇久吾高科技股份有限公司；截留相對分子質(zhì)量（Mw）10 000 膜（PES），廈門國初科技有限公司；截留Mw3500 超濾膜（GK1812），美國通用電氣公司；Waters 2996 高效液相色譜儀，美國沃特世公司；安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm），美國安捷倫科技公司；MV-1800 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；JW-t-0.1B-316 陶瓷膜實(shí)驗(yàn)設(shè)備，江蘇久吾高科技股份有限公司；WTM-0806D 平板膜評價儀，杭州沃騰膜工程有限公司。

杜仲葉，產(chǎn)于江西井岡山，經(jīng)本課題組郭立瑋教授鑒定，為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥葉[8]，干燥至恒定質(zhì)量后磨成粉末后過80 目篩網(wǎng)備用。對照品綠原酸（批號C109403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、蘆?。ㄅ朢189033，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、沒食子酸（批號G131992，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、葡萄糖（批號G116300，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對照品牛血清白蛋白（批號A80132，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%）購于上海麥克林生化科技有限公司。甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 杜仲葉提取液制備

本課題組前期對杜仲葉的水提過程進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，因此本實(shí)驗(yàn)使用的提取方法按前期課題組優(yōu)選的提取方法進(jìn)行提取。稱粉碎的杜仲葉1000 g 至5 L 提取罐，70 ℃加10 倍量純水提取1 h，濾過后取濾渣再加10 倍量純水70 ℃提取1 h，濾過，合并2 次濾液，得杜仲葉水提液12 L（W1）。測量其指標(biāo)性物質(zhì)含量。

2.2 陶瓷膜微濾

將W1 經(jīng)200 nm 陶瓷膜微濾澄清，測量其透過液（W2）中的指標(biāo)性物質(zhì)含量。

2.3 微濾澄清后透過液進(jìn)行超濾

將200 nm 陶瓷膜澄清后的W2 分別過截留Mw10 000、3500 超濾膜，得到透過液（W3、W4），分別測量透過液中指標(biāo)性物質(zhì)含量。杜仲葉水提液澄清、精制的膜集成實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)圖見圖1。

圖1 杜仲葉水提液澄清、精制的膜集成實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)圖Fig.1 Process flow diagram of clarification and refinement of aqueous extracts of Eucommiae Folium via integrated membrane process

2.4 水提液中相關(guān)物質(zhì)含量檢測方法

綠原酸、蛋白質(zhì)、固含量測定依據(jù)《中國藥典》2020年版[8]，總黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3- NaOH 顯色法[9]，總多酚含量測定采用福林酚顯色法[10]，杜仲粗多糖含量測定采用硫酸-苯酚法[11]。所有數(shù)據(jù)取2 次試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值。

2.5 固含物成分的檢測方法

精密稱取1 g 固體粉末，用水溶解后定容至10 mL，測量其相應(yīng)物質(zhì)含量，可得到1 g 固含物中成分含量。

3 結(jié)果和討論

3.1 杜仲葉水提液陶瓷微濾和超濾處理后相關(guān)化學(xué)物質(zhì)含量變化對比

杜仲葉水提液陶瓷微濾和超濾處理后相關(guān)化學(xué)物質(zhì)含量變化對比見表1。除了《中國藥典》2020年版[8]中的指標(biāo)性成分綠原酸外，杜仲多糖[12]、杜仲黃酮和多酚[13]也屬于杜仲葉中含量較高的有效成分，具有抗氧化等功效。表1 中綠原酸為指標(biāo)成分，以膜過程截留率低為優(yōu)；總黃酮和粗多糖亦為有效物質(zhì)，以膜過程截留率低為優(yōu)；總蛋白為大分子雜質(zhì)，宜去除，以膜過程截留率高為優(yōu)。

表1 杜仲葉水提液微濾和超濾處理前后相關(guān)化學(xué)物質(zhì)含量變化Table 1 Comparison of chemical compositions in aqueous extracts of Eucommiae Folium

由表1 可知，經(jīng)200 nm 陶瓷膜（W2）、200 nm陶瓷膜＋Mw10 000 超濾膜（W3）、200 nm 陶瓷膜＋Mw3500 超濾膜（W4）3 種不同膜過程處理后，杜仲水提液的總蛋白大分子物質(zhì)雖然被不同程度去除，但其中指標(biāo)成分綠原酸、粗多糖及總黃酮、總多酚等有效物質(zhì)的含量也呈現(xiàn)下降的趨勢。現(xiàn)有研究只針對水提液中物質(zhì)的截留率，但未有報道指導(dǎo)如何科學(xué)、合理地評估膜過程對杜仲葉水提液澄清、精制作用。

3.2 不同膜過程處理后提取液固含物中相關(guān)成分的分析

對于杜仲水提液原液及經(jīng)過不同膜集成過程后的各透過液進(jìn)行濃縮、干燥，并測定固體中指標(biāo)性成分物質(zhì)含量，分別標(biāo)注為G1（水提液原液濃縮干燥）、G2（200 nm 陶瓷膜透過液濃縮干燥）、G3（200 nm 陶瓷膜＋Mw10 000 超濾膜透過液濃縮干燥）、G4（200 nm 陶瓷膜＋Mw3500 超濾膜透過液濃縮干燥）。按照上述“2.4”項(xiàng)方法，可得到干燥固體所含相關(guān)成分?jǐn)?shù)據(jù)（表2）。其中，綠原酸可作為杜仲葉水提液的指標(biāo)性藥效物質(zhì)，而蛋白質(zhì)可作為必須通過澄清精制工藝去除的大分子物質(zhì)的代表。

由表2 可知，樣品G4，大分子物質(zhì)的代表蛋白質(zhì)的含量最低，僅為0.85 mg/g，而指標(biāo)性成分的代表綠原酸的含量最高，高達(dá)8.88 mg/g，顯著高于G1、G2、G3。說明200 nm 陶瓷膜＋Mw3500 超濾膜工藝的澄清、精制效果優(yōu)于其他的膜工藝。

表2 干燥固體的成分分析Table 2 Chemical compositions of dried solids

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然對表1 的結(jié)果起到佐證、確認(rèn)的作用，但畢竟過程比較繁雜，直到實(shí)驗(yàn)研究最后階段，才能獲取膜工藝過程液體物料干燥后固含物中指標(biāo)性成分的含量。可借助“化學(xué)工程”領(lǐng)域常用的物料衡算原理，探尋更為簡潔的方法。

3.3 基于“物料衡算”原理的液、固體物料指標(biāo)成分含量相關(guān)性研究

在中藥制藥過程中，大部分物料（制劑）最終會被濃縮、干燥成固體形態(tài)（即干浸膏或噴干粉）。根據(jù)“物料衡算”的一般原理，以下公式（1）、（2）成立。

式（1）與（2）的定義不同，由式（2）可知，總固體質(zhì)量由指標(biāo)成分物質(zhì)與其他固體物質(zhì)共同組成。而式（1）中，分母僅為液體物料的質(zhì)量，從而水提液中某指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度并不等同于該指標(biāo)成分在干浸膏（固體中間體）中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。例如，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管在過超濾膜后綠原酸在水提液中含量有所減少（表1 中W4 小于W2），但也同時發(fā)現(xiàn)在過完Mw3500 超濾膜的干浸膏中綠原酸含量卻有所增加（表2 中G4 大于G2）。其結(jié)果是，經(jīng)200 nm 陶瓷膜＋Mw3500 超濾膜處理后，指標(biāo)成分綠原酸在澄清、精制工藝最終產(chǎn)物干浸膏的純度提高了。就基于膜過程的中藥制藥分離技術(shù)而言，液體物料貫穿工藝流程主體，如何遵照“物料衡算”原理，尋找澄清、精制工藝最終產(chǎn)物干浸膏中指標(biāo)成分含量與流程關(guān)鍵工序液體中間體指標(biāo)成分含量的相關(guān)性，對于膜集成工藝路線設(shè)計(jì)事關(guān)重大，是中藥膜過程智能化亟需解決的生產(chǎn)實(shí)際問題。

文獻(xiàn)報道[14]，經(jīng)對118 種《中國藥典》2020年版中藥單方、復(fù)方的水提液（按藥典方法配制）的固含量測試實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中藥提取液原液固含量普遍遠(yuǎn)小于溶劑質(zhì)量（表3）。

表3 118 種中藥單方、復(fù)方水提液固含率測試結(jié)果Table 3 Solid contents of 118 types aqueous TCM extracts

因此，作如下理論推導(dǎo)：根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)，可認(rèn)為，對于中藥提取液原液而言，其總固體質(zhì)量遠(yuǎn)小于水（溶劑）質(zhì)量，因此公式（3）成立。

由式（5），可利用某指標(biāo)性成分在水提液中的濃度與固含率，簡便得出固體干浸膏（固體制劑）的指標(biāo)性成分質(zhì)量。不必再等到全部工藝過程結(jié)束，即可以由膜工藝中間液體物料中某指標(biāo)成分的含量判斷該工藝設(shè)計(jì)是否可以達(dá)到預(yù)期結(jié)果。

為驗(yàn)證本方法的科學(xué)性與可行性，開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。由表4、5 可知，無論是綠原酸，還是蛋白質(zhì)，它們在同一工藝過程節(jié)點(diǎn)干浸膏中含量的實(shí)測值與估算值都極為接近。

根據(jù)上述方法，可由表1 中指標(biāo)成分綠原酸在液體物料中的含量、固含量，推導(dǎo)出3 種膜工藝過程最終產(chǎn)物干浸膏中綠原酸的含量。

由上述計(jì)算結(jié)果可知，G4 中綠原酸的含量最高，即可認(rèn)為200 nm 陶瓷膜＋Mw3500 超濾膜是本實(shí)驗(yàn)的最佳膜集成工藝。

作為實(shí)際生產(chǎn)中對膜澄清、精制工藝科學(xué)、合理性判斷的一種簡便方法，式（5）雖有一定局限性，但作為解決復(fù)雜體系膜工程化問題的手段，則表現(xiàn)出較大的靈活性和實(shí)用性。

4 結(jié)語

中藥制藥工藝是影響中藥質(zhì)量最為關(guān)鍵的因素之一，本研究創(chuàng)造性地建立液、固體物料指標(biāo)成分含量相關(guān)性模型，并將其對中藥制藥中間體最終產(chǎn)物質(zhì)量推測的結(jié)果，作為工藝優(yōu)選的依據(jù)，為在實(shí)際中藥生產(chǎn)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)“前瞻性”設(shè)計(jì)提供了技術(shù)支撐。本研究針對“過程的開發(fā)及優(yōu)化”，引進(jìn)“化工過程控制”原理：對于復(fù)雜的化工過程，不能滿足于在現(xiàn)有裝置上通過測試獲得所需的對象動態(tài)特性知識，更重要的是，在對象處于設(shè)計(jì)階段，就能利用計(jì)算方法預(yù)估其特性，以改變“黑匣”無知狀態(tài)，指導(dǎo)工藝設(shè)計(jì)中的原理性設(shè)計(jì)。據(jù)此所開展的面向中藥澄清精制膜工藝過程評估模式創(chuàng)新，不僅為中藥制藥學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)全面兼容提供了新方法，而且也為構(gòu)建“中藥制藥分離過程工程原理”理論體系提供了新視野。

表4 杜仲葉水提液澄清、精制膜集成工藝過程中綠原酸的物料衡算Table 4 Mass balance analysis of chlorogenic acid in aqueous extracts of Eucommiae Foliumvia integrated membrane process of clarification and refinement

表5 杜仲葉水提液澄清、精制膜集成工藝過程中蛋白質(zhì)的物料衡算Table 5 Mass balance analysis of proteins in aqueous extracts of Eucommiae Folium via integrated membrane process of clarification and refinement

志謝：廣州中國科學(xué)院先進(jìn)技術(shù)研究所中藥綠色制造工藝研發(fā)與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室的高效液相設(shè)備，宋宏臣博士及其課題組成員提供陶瓷膜設(shè)備，何敬愉博士對前期實(shí)驗(yàn)提供的幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突