Micro-CT檢測STZ誘導的糖尿病大鼠牙槽骨微結構改變

易子欣，易 婷，姚心雨，祝貝貝，賁亞琍，張 雯

（江漢大學醫學院口腔醫學系，湖北武漢 430000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌不足（1 型糖尿病）或胰島素抵抗（2 型糖尿病）引起的一組代謝性疾病。糖尿病患者的高血糖環境，誘發結構蛋白和基質分子氧化產生晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs），導致毛細血管病變[1-3]，引發多種并發癥。牙周病是涉及牙周支持組織的炎性和破壞性疾病，臨床特征包括牙齦炎癥、牙周附著喪失、牙周袋形成和牙槽骨吸收。研究表明糖尿病與慢性牙周炎之間有著雙向的密切關系[4]。糖尿病可以引發牙周組織氧化應激，進而導致牙周組織的進一步損傷以及牙槽骨的吸收[5-7]。微計算機斷層掃描技術（micro computed tomography，Mi?cro-CT）可準確有效觀察骨組織細微結構，其分辨率達到微米級別，能對小型樣本重建并呈現3D 影像，對標本進行定性及定量分析[8]。本實驗擬以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1 型糖尿病大鼠模型，探討Micro-CT掃描技術用于觀測糖尿病大鼠牙槽骨微結構的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗選用健康雄性Sprague-Dawley 大鼠（5～ 6周齡，體重約200～225 g）8只，贛南醫科大學動物中心購入并通過動物倫理審核。STZ 購自德國Boeh?ringer Mannheim 公司；乙二胺四乙酸二鈉（10%EDTA），蘇木素染料，伊紅染料（購自美國Sigma 公司）；血糖試紙（購自Miles Australia Pty.Ltd）；4%多聚甲醛（購自中國上海生物工程有限公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD 大鼠隨機分為對照組和STZ（糖尿病）組（n=4），自由飲水和攝食，常規飼養一周后進行實驗。STZ組大鼠腹腔內注射55 mg/kg STZ[9]，對照組大鼠給予同等體積的0.1 M檸檬酸鹽緩沖液。72 h后大鼠空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L 的大鼠被視為糖尿病造模成功。繼續飼養12 周，并于第6 周和12 周檢測大鼠空腹血糖水平。

1.3 HE染色

處死大鼠，取上頜骨，經生理鹽水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。保持組織細胞基本固有物質，并使組織硬化。右側上頜骨于10%EDTA溶液脫鈣8 周。經脫水、包埋制備石蠟切片。選擇包括完整的冠、根和牙周組織進行切片（5 μm，中軸方向）。切片放入蘇木素染液中浸染5 min，流水沖洗返藍，再沖洗，后用酒精脫水，伊紅染液浸染5 min。400倍光學顯微鏡下拍攝大鼠上頜磨牙間牙齦乳頭部位照片，CaseViewer 2.0進行分析，評估釉牙骨質界（ce?mento-enamel junction，CEJ）牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的距離。

1.4 Micro-CT掃描成像分析

使用Micro-CT（SkyScan1176，Bruker，Kontich，比利時）掃描大鼠右側上頜骨樣本。掃描完成后，軟件CT analyser 手動選擇興趣區間（Region of interest，ROI）：右側上頜第一磨牙根分叉區域。軟件Datev?iewer 對ROI 進行三維重建，觀察牙槽骨吸收情況。軟件CT analyser對ROI區域的骨小梁結構進行參數測量，測量三次取平均值。主要測量參數包括骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁間距（trabec?ular separation，Tb.sp）。CT analyser 像素（pixel size）18 μm，最低灰度閾值（lower grey threshold）95，最高灰度閾值（upper grey threshold）255。

1.5 統計學分析

使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差（）表示。兩個獨立樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病模型大鼠的血糖值變化

STZ組大鼠腹腔注射STZ后，第6周和12周分別檢測血糖，STZ 組大鼠的空腹血糖水平均≥ 16.7 mmol/L，72 h后空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L，提示造模成功，見表1。正常對照組大鼠空腹血糖水平保持在5.0 mmol/L左右。

表1 STZ誘導糖尿病大鼠模型的不同時間血糖值變化（mmol/L）

2.2 HE染色切片分析大鼠牙槽骨吸收程度

HE染色觀察大鼠上頜磨牙間牙槽嵴頂部位，可見正常對照大鼠牙槽骨邊緣光滑，牙周膜纖維排列整齊，見圖1A。STZ 組大鼠牙槽骨邊緣可見明顯吸收，牙周膜纖維排列紊亂，牙齦上皮有明顯的炎癥細胞浸潤，見圖1B。CaseViewer 2.0 軟件測量CEJ-ABC距離，結果顯示STZ 組相較正常對照組CEJ-ABC 距離明顯增加，差異有統計學意義（t=2.492，P <0.05），見圖1C。

圖1 大鼠上頜骨磨牙HE染色（×40）

2.3 Micro-CT分析牙槽骨微結構

Micro-CT 掃描大鼠右側上頜骨樣本進行重構后，比較兩組牙槽骨吸收程度。可見較正常對照組，見圖2A，STZ組大鼠上頜骨磨牙矢狀正中面，有明顯牙槽骨吸收見圖2B。與對照組比較，STZ組骨小梁數目（Tb.N）明顯降低（t=4.610，P<0.05），見圖2C，骨小梁間距（Tb.sp）明顯升高（t=2.678，P<0.05），見圖2D。

圖2 大鼠右側上頜第一磨牙Micro-CT 分析

3 討論

牙周病是多因素疾病，牙周微生物觸發的炎癥反應是牙周病的關鍵因素[10]。革蘭氏陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌是成人慢性牙周炎的重要病原體[11]，其主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），導致多種前炎癥介質的釋放[12]，并通過活化破骨細胞及抑制成骨細胞的成骨功能，加重骨質流失進而引發牙槽骨的吸收[13]。另一方面，慢性牙周炎與糖尿病之間存在密切的雙向關系[14-16]。糖尿病引發的牙周高血糖環境，AGEs的形成，組織氧化應激反應的增強，易可活化NF-κB信號途徑，導致大量前炎癥因子的釋放，誘發慢性炎癥[17]。高血糖環境導致的免疫-炎癥應答紊亂，活化了機體固有免疫系統，上調前炎癥介質，進而加重牙周破壞[18]。

本研究采用55 mg/kg STZ腹腔注射，72 h后大鼠的血糖水平≥16.7 mmol/L，血糖追蹤12 周，STZ 組大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L，表明成功建立了糖尿病大鼠模型。鏈脲佐菌素STZ 是一種廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤的用途[19]，因其可被胰島β細胞表面的葡萄糖轉運蛋白GLUT2 轉運至β細胞內，因此對實驗動物胰島β細胞具有特異性損傷，誘導產生1 型糖尿病[20]。對建模12 周后的STZ 組大鼠上頜骨進行HE染色分析，可見STZ組大鼠牙齦呈明顯的炎癥細胞浸潤，牙槽骨邊緣觀察到骨吸收陷窩，CEJ-ABC較對照組降低。Micro-CT分析顯示，STZ組骨小梁數量（Tb.N）下降，骨小梁間距（Tb.sp）較對照組顯著升高，掃描成像亦可見明顯的牙槽骨吸收。Micro-CT及HE染色結果一致，均呈現了STZ組大鼠牙槽骨吸收。以上結果證實，單純的血糖水平增高亦可導致大鼠實驗性牙周組織破壞。

研究分別采用Micro-CT和HE染色對糖尿病大鼠上頜骨模型進行分析。相較于傳統的HE 染色方法，組織進行Micro-CT前不需要脫鈣等繁瑣的標本處理過程，對樣本損傷小。實驗中Micro-CT 骨微結構參數選用了骨小梁數量Tb.N 和骨小梁間距Tb.Sp。Tb.N 通過計算單位長度內骨組織與非骨組織的交點數量評價每毫米內的骨小梁數量；Tb.Sp 通過計算骨小梁之間髓腔的平均寬度評價骨小梁間隙。Tb.N和Tb.Sp，通過對松質骨骨小梁結構進行分析，以動態的眼光定量分析STZ誘導的糖尿病大鼠牙槽骨改變。顯然，Micro-CT能夠通過自身處理軟件重構獲得骨內部詳細的圖像，進行精準性定量分析，在骨微結構分析方面具有明顯優勢。該方法作為一種準確、快速、高分辨率的觀測方法，適用于大鼠牙槽骨分析。

4 結論

本實驗通過STZ 建立大鼠糖尿病模型，同時利用Micro-CT技術呈現牙周骨組織微結構，獲得精確參數，為后續糖尿病牙槽骨的研究奠定基礎。