不同粗糙度鈦表面形貌對人牙齦成纖維細胞黏附及整合素α5基因表達的影響

呂吉利 宣麗娜 馮丹峰 黎紅*

種植義齒具有“人類第三幅牙齒”之稱［1］，是目前最受歡迎的缺牙修復(fù)方式之一。近期研究發(fā)現(xiàn)種植術(shù)后種植體周圍炎以及種植體周圍黏膜炎發(fā)生率達19.83%和46.83%［2］，是導(dǎo)致種植體失敗的主要原因之一。種植體-軟組織界面的結(jié)締組織具有支持、免疫監(jiān)控、促進修復(fù)等作用［3］，研究表明種植體周圍軟組織封閉水平弱于天然牙［4］，這種較弱的軟組織封閉水平可能是導(dǎo)致種植體失敗的原因之一。整合素作為牙齦成纖維細胞黏附過程中重要的蛋白，較多研究證實通過不同的種植體表面處理方式可以促進整合素的基因表達，其中物理改性是較為安全穩(wěn)定的方法之一［5］。本文探討不同粗糙度鈦表面形貌對人牙齦成纖維細胞黏附及整合素α5基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 無水乙醇、蒸餾水、37%濃鹽酸、濃硫酸、氧化鋁細砂（綠新源）、鈦圓盤（柏泰）、PBS溶液（諾森德）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國）、胎牛血清（四季青）、CCK8試劑盒（碧云天）、DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國）、Trizol（Takara）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR047）、PCR試劑盒（Takara RR420）。

1.2 試件制備及表征 將直徑15 mm、高度1 mm的100枚鈦圓盤隨機分為A組、B組、C組及D組，A組采用機械拋光處理，記為Ti組，B組、C組及D組分別采用直徑45 μm、125 μm及250 μm的氧化鋁細砂進行表面噴砂處理（JNSP-Ⅰ型濕噴砂機，壓力：0.4 MPa，距離7 cm，時長：1 min）。將所得鈦圓盤經(jīng)蒸餾水沖洗、超聲20 min后進行熱酸蝕處理。B組采用低濃度混合酸（60% H2SO4：10% HCL：蒸餾水按1∶1∶2混勻）100 ℃水浴20 min，蒸餾水沖洗后分別經(jīng)蒸餾水、75%乙醇、蒸餾水超聲10 min，高溫高壓蒸汽滅菌后保存?zhèn)溆茫洖門i45組。C組及D組采用高濃度混合酸（50% H2SO4∶10% HCL按1∶1混勻）100 ℃水浴20 min，蒸餾水沖洗后分別經(jīng)蒸餾水、75%乙醇、蒸餾水超聲10 min，分別記為Ti125組及Ti250組，高溫高壓蒸汽滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 從4組試件中分別隨機抽取5枚鈦圓盤，每枚鈦圓盤分別選取上中下三個測試位點，利用探針式輪廓測試儀檢測表面粗糙度（Ra）。記錄后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 牙齦成纖維細胞獲得 在經(jīng)過志愿者知情同意后，取因正畸或阻生齒需拔牙或需冠延長手術(shù)且牙齦無炎癥患者（12~35歲）的牙齦組織（經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準）。采用改良組織塊培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)，5 d左右觀察細胞爬出后更換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液并去除漂浮組織塊及雜質(zhì)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時常規(guī)按1∶2傳代，3~5代細胞采用含10% DMSO的胎牛血清凍存于液氮中備用。

1.5 細胞分離率 將消毒后鈦圓盤試件治愈超凈工作臺上紫外燈照射下過夜，每組取6個鈦圓盤放置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的3~6代細胞以3×104/ml濃度接種至24孔板內(nèi)，每孔1 ml，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)24 h培養(yǎng)穩(wěn)定后，小心吸出原培養(yǎng)液并用PBS溶液沖洗后吸凈，加入稀釋后的0.125%的胰酶溶液1 ml，并于搖床上以150 r/min速度作用1 min，培養(yǎng)液終止消化，小心吸出四組液體分別移入EP管中，剩余鈦片上再次加入1 ml稀釋胰酶溶液，作用1 min后終止消化，并用1000 ml移液槍反復(fù)吹打鈦圓盤，收集剩余四組液體，將2次液體1500 r/min、5 min離心，棄上清液，重復(fù)3次，每支EP管中加入200 μl培養(yǎng)液，小心吹打均勻，并接種于96孔板中，置入CO2培養(yǎng)箱中，24 h后細胞生長穩(wěn)定，吸出原培養(yǎng)液，加入PBS小心清洗并吸凈，每孔加入100 μl DMEM培養(yǎng)液及10 μl CCK8試劑，周圍空白孔用100 μl培養(yǎng)液充填，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀測量450 nm波長處吸光度OD值，重復(fù)測量3次，將初始消化后OD值記為A1，最終消化后OD值記為A2，并按照公式計算細胞分離率：細胞分離率=A1/（A1+A2）×100%。分離率與黏附強度成反比，細胞黏附強度可進一步計算經(jīng)胰酶及搖床處理后存留在鈦圓盤的細胞量與總細胞量比值表示，按公式進行計算：細胞黏附強度=A2/（A1+A2）×100%。

1.6 整合素α5的mRNA表達 相同加工方法制作直徑為15 mm的各組試件，消毒后置于24孔板中，每組5個孔，每孔接種HGF 3×104個，培養(yǎng)至細胞生長穩(wěn)定。鈦片試件用新鑷子小心移至新24孔板中，PBS沖洗，吸干，每孔加200 μl Trizol，收集每組5個孔的trizol裂解液至EP管中，抽提總RNA，Nano Drop 2000測定各組總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，按照Takara RR420條件要求嚴格進行實時熒光定量PCR（qPCR），各引物序列及大小見表1。重復(fù)3次/組，每次每組每基因3個復(fù)孔。LightCycler 480軟件導(dǎo)出各組CT值。以光滑鈦組為對照組，采用2-△△CT法計算整合素α5的mRNA的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實時熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 四組材料表面粗糙度比較 見表2。

表2 四組材料表面粗糙度比較（±s）

表2 四組材料表面粗糙度比較（±s）

注：與Ti組比較，*P<0.05；與Ti45組比較，#P<0.05；與Ti125組比較，△P<0.05；與Ti250組比較，▲P<0.05

組別 n 粗糙度（μm）Ti組 10 0.09±0.03#△▲Ti45組 10 0.47±0.03*△▲Ti125組 10 1.65±0.05*#▲Ti250組 10 2.93±0.06*#△

2.2 四組掃描電鏡觀察結(jié)果 Ti組鈦試件并非完全光滑，其表面可見細微劃痕分布。其余三組粗糙表面可見大量微米級凹坑分布，呈兩級分布，較大的一級凹坑及較小的二級凹坑。二級凹坑均勻分布于一級凹坑內(nèi)或一級凹坑間。Ti45組表面一級凹坑較小，直徑大約2 μm，而Ti250組表面一級凹坑直徑較大，約2~3 μm，Ti125組位于兩組之間。見圖1。

圖1 四組材料掃描電鏡觀察（×5000）

2.3 四組細胞黏附強度比較 Ti組細胞黏附強度高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.4 四組HGF整合素α5 mRNA表達比較 Ti組、Ti45組、Ti125組及Ti250組整合素α5的mRNA表達量依次降低，且Ti組高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖2 四組黏附強度比較

圖3 四組整合素mRNA表達情況

3 討論

隨著研究的不斷深入，對于種植體周圍病的認識進一步加深。口腔內(nèi)擁有超過10,000種細菌表型［6］，細菌的大量聚集會導(dǎo)致種植體周圍黏膜炎甚至種植體周圍炎的發(fā)生，如何加強種植體周圍軟組織封閉作用成為目前的研究熱點。表面改性是增強軟組織黏附作用的有效方法［7］，陽極氧化、光功能化、微弧氧化、微溝槽處理、噴砂酸蝕法等是目前研究的主要方向［8］，哪種方法最有效目前尚未有定論。表面形貌對于細胞黏附、爬行及生長具有重要影響，而表面粗糙度是表面形貌的重要指標(biāo)之一。有研究認為微粗糙的表面增加表面能及表面積，更易于體液中的大分子物質(zhì)沉積吸附，從而增加細胞的黏附點［9］。本課題組通過噴砂酸蝕法成功獲得具有四種典型粗糙度的鈦圓盤試件，各組間粗糙度差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

牙槽骨是終生處于動態(tài)變化的，種植體邊緣骨受生理及病理因素的影響而出現(xiàn)吸收，為了維持生物學(xué)寬度導(dǎo)致結(jié)合上皮的根向遷移。HERMANN［10］通過X線片發(fā)現(xiàn)種植體邊緣骨在Ⅱ期手術(shù)暴露種植體及安放愈合基臺后會發(fā)生改建，導(dǎo)致邊緣牙槽骨吸收至種植體-基臺界面下方，為了維持種植體生物學(xué)寬度的穩(wěn)定，軟組織隨之改建，導(dǎo)致上皮根向遷移，經(jīng)過這一系列的改建，結(jié)締組織最終部分或全部遷移至種植體粗糙頸部。目前為了獲得良好的骨結(jié)合，絕大多數(shù)種植體采用經(jīng)過各種表面處理得到的粗糙表面，Straumann公司提出大顆粒噴砂酸蝕法得到的粗糙SLA表面形貌是目前主流的種植體表面之一。尋找一種合適粗糙度的種植體表面在不影響骨結(jié)合的同時增強軟組織黏附及減少菌斑附著具有重要意義。

目前研究發(fā)現(xiàn)種植體周圍軟組織愈合與天然牙的軟組織屏障存在明顯不同。種植體周圍的軟組織愈合形式實際上是一種異物反應(yīng)，最終形成類似于“瘢痕”組織［11］，對于機械力的抵抗作用更弱。KOKUBU［12］研究表明SLA表面可以增強牙齦成纖維細胞的黏附，但也有學(xué)者［13］認為光滑表面更利于成纖維細胞的黏附鋪展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，相比于粗糙表面，較為光滑的Ti組表面的牙齦成纖維鋪展面積更大，細胞相互連接成網(wǎng)狀，而粗糙表面細胞則生長方向各異，鋪展面積不如光滑表面，但細胞呈三維立體狀黏附于材料表面，這導(dǎo)致細胞需要更多時間適應(yīng)粗糙表面，且不利于細胞的爬行［14］。本實驗通過細胞分離率發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細胞在低粗糙度的Ti組表現(xiàn)出更強的黏附能力。表明表面形貌導(dǎo)致細胞鋪展形式不一，Ti組細胞鋪展更完全，利于細胞的黏附，與前期掃描電鏡下觀察到的細胞鋪展情況相一致。

整合素是存在于細胞膜表面的一種跨膜蛋白，由α亞基及β亞基組成的異質(zhì)二聚體，目前研究發(fā)現(xiàn)18種α亞基及8種β亞基［15］，幾乎所有細胞表面都存在至少一種整合素。成纖維細胞表面主要表達整合素α5β1亞型。進一步的研究發(fā)現(xiàn)整合素可能通過細胞外基質(zhì)-整合素-細胞骨架系統(tǒng)形成雙向的力學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)［16］。表面形貌的改變會對細胞產(chǎn)生一定的力學(xué)刺激，通過整合素向內(nèi)傳導(dǎo)影響相關(guān)基因表達，調(diào)節(jié)細胞骨架使細胞產(chǎn)生形變并影響細胞的黏附［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)Ti組整合素α5的mRNA表達明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這可能與粗糙表面主要以微米級形貌改變相關(guān)，對于牙齦成纖維細胞的形態(tài)改變影響較大，細胞鋪展面積減少導(dǎo)致細胞黏附點減少，進而導(dǎo)致整合素α5的mRNA表達減少。此外，親水性可能也是導(dǎo)致整合素α5基因表達降低的原因。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，隨著粗糙度的增加，親水性降低［14］，而親水性的降低會導(dǎo)致體液中的蛋白等基質(zhì)的吸附降低，而成纖維細胞的黏附需要通過整合素等與細胞外基質(zhì)的特異性位點識別并結(jié)合，因此可能導(dǎo)致整合素α5的表達降低。

綜上所述，在四組不同粗糙度鈦試件組中，Ti組（Ra=0.09±0.03 μm）牙齦成纖維細胞表現(xiàn)出更強的黏附強度，過度增加粗糙度不利于牙齦成纖維細胞的黏附生長。通過RTq-PCR檢測發(fā)現(xiàn)隨著粗糙度的增加，整合素α5的基因表達降低，且Ti組整合素α5表現(xiàn)出較高的基因表達水平（P<0.05），推測由于粗糙度的增加導(dǎo)致親水性降低有關(guān)。同時有學(xué)者［18-19］提出納米級或微納米級表面對于牙齦成纖維細胞的增殖有明顯促進作用。未來將進一步研究納米級表面形貌對于牙齦成纖維細胞黏附及相關(guān)基因表達的影響。