DAX-1真核表達載體的構建及其活性的檢測

楊麗華 王芳 余柯達 鄒立波

劑量敏感的性別反轉先天性腎上腺發育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal，adrenal hypoplasia critical region，on chromosome X，gene 1，DAX-1），又稱NR0B1（nuclear receptor subfamily 0，group B，member 1）是編碼核受體超家族1蛋白的成員。人類DAX-1 基因位于X染色體p21，編碼一個含470個氨基酸的蛋白質，是一種轉錄因子，主要在哺乳動物的生殖系統中表達，如睪丸、卵巢、下丘腦、垂體、腎上腺等［1］。已有研究證明腎上腺發育不全、促性腺激素分泌不足的性腺機能減退及男性不育癥的發病與DAX-1突變有關［2-3］。本研究擬構建人DAX-1 的真核表達載體，并利用雙熒光素酶報告系統檢測其轉錄活性，為后續研究DAX-1突變致病及DAX-1表達調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎上腺皮質瘤細胞（Y-1）購自中科院上海細胞庫，人睪丸組織的RNA、高保真DNA聚合酶購自Takara公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒購自Omega公司，引物合成及DNA測序于上海英濰捷基貿易有限公司完成，脂質體 LipofectamineTM2000、載體購自Invitrogen 公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，DMEM 培養液、胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司，培養皿、培養板、移液管等耗材均購于Corning公司。

1.2 方法 （1）人DAX-1基因cDNA編碼區全長序列的獲取根據Gene bank中DAX-1的序列用 Prime premier 5.0 軟件設計引物。DAX-1引物序列：上 游5'CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3'下 游5'CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3'分別在上游和下游引物的5'端加上Hind Ⅲ和BamH1酶切位點。將人睪丸組織RNA逆轉錄合成cDNA，方法參照Fermentas反轉錄試劑盒說明書。以cDNA為模板進行PCR反應，反應體系：cDNA（0.1 μg/μl）：1 μl；5×Prime STAR GXL Buffer：10 μl；dNTP Mixture（2.5 mM each）：4 μl；primer F（10 pM）：1 μl；primer R（10 pM）：1 μl；Prime STAR GXL DNA Polymerase：2 μl；H2O：31 μl；總體積50 μl。PCR循環條件：①98℃ 2 min；②98 ℃10 s；③60 ℃15 s；④68℃1 min 45 s；⑤重復②~④步驟，進行30個循環；⑥68 ℃ 5 min；⑦4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物大小。（2）重組質粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1的構建：用膠回收試劑盒回收擴增的PCR產物，用Hind Ⅲ-HF和BamH1-HF分別雙酶切PCR產物和帶HA多肽標簽的pcDNA3.1（+）' 37℃ 4 h。反應體系分別為：①PCR產物30 μl；NE Buffer 4 5 μl；Hind III-HF 1 μl；BamH1-HF 1 μl；ddH20 13 μl；總體積 50 μl；②pcDNA3.1（+）-3' HA 10 μl；NE Buffer 4 5 μl；Hind III-HF 1 μl；BamH1-HF 1 μl；ddH20 33 μl；總體積50 μl。對酶切后的產物分別進行柱回收和膠回收，T4 DNA連接酶連接回收后產物，連接體系：pcDNA3.1（+）-3'HA：2 μl；回收的DNA片段6 μl；T4 Ligase 1 μl；10×Ligation Buffer：1 μl，16 ℃ 8 h，取連接產物5 μl加入到50 μl DH5a感受態細胞中，置于冰上30 min，42 ℃熱擊45 s，冰上放置2 min，加入600 μl不含抗生素的LB培養液，37 ℃搖床培養60 min，取200 μl涂板（含100 μg/ml氨芐青霉素的培養板），放37 ℃培養過夜。挑克隆進行菌液PCR驗證，取陽性克隆送測序。③瞬時轉染Y-1細胞：用含有10%胎牛血清DMEM完全培養基培養Y-1細胞，放置于37℃、5%CO2培養箱中，按照無菌操作臺內的常規細胞培養方法培養。將處于對數生長期的Y-1細胞以1.5×105/孔密度接種于24孔培養板，待第2天細胞貼壁后，根據轉染試劑LipofectamineTM 2000的轉染步驟，將重組質粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1與StAR（實驗組，各100 ng）和pcDNA3.1（+）-3'HA空載與StAR（對照組，各100 ng）分別共轉染到Y-1細胞中。實驗組與對照組均轉染TK（10 ng）作為內參。轉染24 h后收集細胞，檢測熒光素酶活性。上述實驗每組設3個平行孔，每組實驗重復3次。④熒光素酶活性測定：按照Promega公司雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測在Y-1細胞中DAX1對StAR啟動子熒光素酶活性的改變。用1×PBS溶液將細胞洗滌2次，向每孔中加入100 μl 1×Passive Lysis Buffer，在室溫下輕晃15 min裂解細胞。分別取裂解液5 μl，加底物熒光素（LARII）19 μl在Modulus TM多功能光度計上測定螢火蟲熒光素酶活性，后加入終止液（STOP）19 μl檢測海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎素熒光素酶活性的值作為熒光素酶活性。以轉染pcDNA3.1（+）-3'HA空載和StAR的Y-1細胞作為對照，實驗組的熒光素酶活性為其相對值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學差異。

2 結果

2.1 PCR法獲得DAX-1基因 利用PCR法，成功獲取約1413 bp的目的片段，見圖1。

圖1 DAX-1基因的PCR擴增結果

圖2 重組質粒pcDNA3.1（+）-3'HADAX1雙酶切結果

2.2 重組載體的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳酶切結果顯示，近1413bp處的條帶為酶切后的目的片段，測序結果也顯示該片段為DAX1編碼基因，表明pcDNA3.1（+）-3'HADAX1構建成功。實驗重復3次，結果均一致。見圖2。

2.3 熒光素酶活性的檢測 實驗組熒光比值 為（0.065±0.002）；對照組熒光比值為（0.198±0.128）， 兩組差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 雙熒光素酶報告系統測定DAX-1活性結果

3 討論

目前全球約有15%的育齡夫婦面臨不能生育的困擾，其中50%是由于男性不育。近年來，其發病率逐年增加且逐漸傾向年輕化［4］。男性不育發病因素具有復雜性和多樣性的特點，其具體發病機制尚不明確，但從家族病例報道、小鼠模型及二代測序等的研究成果中可以推斷遺傳因素起較大作用［5］。越來越多的研究證實基因突變與男性不育的相關性［6］。這些基因的突變可使青春期發育受損，隨后由于下丘腦-垂體對性腺或其基因有重要促進作用的因子缺乏，最終引起男性不育。DAX-1即是屬于下丘腦-垂體-性腺軸上的基因，其編碼蛋白是核受體家族的成員。DAX-1蛋白作為一種轉錄因子對垂體促性腺細胞和腎上腺皮質的發育起非常重要的作用，已有研究證明腎上腺發育不全及促性腺激素分泌不足的性腺機能減退的發病與DAX-1突變有關［2］。DAX-1敲除的雄性小鼠性腺機能減退、精子發生異常、生精上皮細胞退化［7］。DAX-1在大鼠Sertoli細胞中的表達受FSH激素水平的調節，進一步證明在出生后水平DAX-1可能對精子發生產生影響，且睪丸中DAX-1在精子發生中的作用與觀察到的某些生精障礙的腎上腺發育不全及促性腺激素分泌不足的性腺機能減退患者相一致［8］。2014年，作者對766例男性原發性無精子癥患者DAX-1基因外顯子進行測序，同樣也證實DAX-1基因的變異與原發性無精癥的發生存在相關性，表明DAX-1可能是臨床男性不育一個潛在的診療靶點［3］。StAR基因編碼類固醇激素靈敏調節蛋白，主要在腎上腺、睪丸、卵巢等與類固醇激素生成有關的細胞和組織中表達。該基因的表達受許多調節因子的正負調控，這些調節因子可與StAR啟動子上的調控元件相互作用。研究表明，DAX-1蛋白與StAR基因啟動子區域的發夾結構相互作用，抑制其轉錄，調控腎上腺及性腺的發育［9］，DAX-1某些點突變可使該抑制作用喪失，可能對精子發生產生影響，從而導致男性不育的發生［10］。

報告基因技術近年來普遍用于分析啟動子活性，其靈敏度較高、檢測方便且具有內參照，可提高實驗的準確度。雙熒光素酶報告基因檢測系統中含有在同一細胞中同時表達的兩種熒光素酶，經過內參照的處理可以減小細胞活性和轉染效率對實驗的影響，因此雙報告系統減少外部干擾，使實驗數據更可信。本實驗成功構建人DAX-1真核表達載體并采用雙熒光素酶報告系統檢測其具有轉錄活性，可與StAR啟動子上的調控元件相互作用，明顯下調StAR基因的表達，為進一步研究DAX-1功能及調控機制奠定實驗基礎。