熒光假單胞菌YG-1與殺菌劑復(fù)配對番茄灰霉病的聯(lián)合毒力

張 萌 翟乾行 朱承余 鄭麗寧 張 浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，吉林長春 130118）

化學(xué)殺菌劑在植物病害防治中起著重要的作用，但是長期使用后抗藥性增強(qiáng)，防效降低、用量增大，同時污染生態(tài)環(huán)境（趙新貝 等，2016）。如何減少化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生副作用是目前亟待解決的問題。生物防治是最具潛力并可良好替代化學(xué)農(nóng)藥的安全防治技術(shù)（張慶萍 等，2019）。番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一種危害嚴(yán)重的世界性病害（李培謙 等，2018；潘曉梅 等，2019）。長期以來，防治番茄灰霉病的方法主要是大量施用化學(xué)農(nóng)藥，但是灰霉病菌繁殖快、變異度大等特點(diǎn)使得病菌對化學(xué)藥劑極易產(chǎn)生抗藥性，另一方面人們對抗藥性及食品安全問題的認(rèn)識不斷提高，使得利用生物防控技術(shù)防治灰霉病菌的需求更加迫切（韓麗 等，2013）。生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，具有選擇性強(qiáng)、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、不破壞生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)（畢秋艷 等，2015），現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是能夠控制果蔬病害的一類重要生防菌，其分布廣泛，施用方便，能有效抑制多種病原微生物，防治柑橘青霉病和綠霉病具有很好效果，而且對煙草灰霉菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用（李悅 等，2014；王智榮，2019）。

為了提高拮抗菌的防治效果，減少化學(xué)藥劑的使用量，本試驗(yàn)從8 種化學(xué)殺菌劑中選擇啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配，旨在篩選出對番茄灰霉病菌控制效果比較好的藥劑及最適的配比，為番茄灰霉病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019 年5—10 月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地溫室大棚和資源與環(huán)境學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 熒光假單胞菌YG-1 菌株（P.fluorescens）和番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)研究室分離獲得。

1.1.2 化學(xué)殺菌劑 50%腐霉利WP（霍州市綠洲農(nóng)藥有限公司），50%異菌脲WP（山東澳得利化工有限公司），25%嘧菌酯SC（江蘇利民化工有限公司），25 g · L-1咯菌腈EC（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），250 g · L-1吡唑醚菌酯EC（杭州宇龍化工有限公司），50%氟啶胺SC（喬貝爾作物保護(hù)有限公司），50%啶酰菌胺WG（巴斯夫歐洲公司），80%嘧霉胺WDG（山東綠豐農(nóng)藥有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基及番茄品種 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1.0 L。

LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1.0 L。

番茄品種：大地紅寶石，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 不同殺菌劑對番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法（趙冬梅 等，2017；馬超 等，2018）測定8 種殺菌劑對番茄灰霉病菌的抑制作用。取適量無菌水分別將8 種殺菌劑溶解于100 mL 容量瓶中定容，制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg · L-1的母液。將10 mL 用無菌水稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的母液與40 mL 滅菌PDA 培養(yǎng)基均勻混合，制成5 個不同梯度濃度的含藥培養(yǎng)基，其中咯菌腈、啶酰菌胺含藥培養(yǎng)基濃度為2、0.4、0.08、0.016、0.003 2 mg · L-1，吡唑醚菌酯、腐霉利、嘧霉胺、異菌脲含藥培養(yǎng)基濃度為10、5、2.5、1.25、0.625 mg ·L-1，氟啶胺、嘧菌酯含藥培養(yǎng)基濃度為50、10、2、0.4、0.08 mg · L-1，對照組為等量無菌水與PDA 培養(yǎng)基均勻混合。將番茄灰霉病菌直徑為5.0 mm 的菌餅接種到含藥培養(yǎng)基中心培養(yǎng)5～6 d，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。通過十字交叉法測定各處理菌落直徑，并計算抑制率（楊利敏，2015；范文忠 等，2019）。

抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑× 100%

1.2.2 熒光假單胞菌對番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定 將熒光假單胞菌YG-1 在固體LB 培養(yǎng)基上活化，活化后接種到含有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到接種液，將所得接種液分別配制成濃度為1.0 × 105、1.0 × 106、1.0 × 107、1.0 × 108、1.0 × 109CFU · mL-1的發(fā)酵液。采用1.2.1 的方法測定不同濃度熒光假單胞菌YG-1 培養(yǎng)基上番茄灰霉病菌的菌落直徑，計算抑制率，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。

1.2.3 熒光假單胞菌YG-1 與殺菌劑的生物相容性

根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果將具有較強(qiáng)毒力的2 種殺菌劑配制成質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 mg ·L-1的LB 含藥培養(yǎng)基，然后用移液槍吸取10 μL 熒光假單胞菌YG-1。將發(fā)酵液覆蓋在含藥平板表面，空白對照組加入等量的無菌水，并置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組處理3 皿，3 次重復(fù)。通過平板菌落計數(shù)法檢測熒光假單胞菌的生長情況，并記錄菌落數(shù)量。

1.2.4 復(fù)配劑對番茄灰霉病菌的毒力測定 根據(jù)8種殺菌劑毒力測定結(jié)果及熒光假單胞菌與殺菌劑的生物相容性，選取啶酰菌胺與熒光假單胞菌YG-1進(jìn)行復(fù)配。以啶酰菌胺和熒光假單胞菌的到有效中質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)，分別將藥劑及發(fā)酵液配制到有效中質(zhì)量濃度0.081 mg · L-1與1.97 × 108CFU ·mL-1，再按V（啶酰菌胺）∶V（熒光假單胞菌）=10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10 進(jìn)行復(fù)配，并且根據(jù)復(fù)配劑對番茄灰霉病菌的實(shí)際抑制生長率及預(yù)期抑制生長率，計算毒性比率。毒性比率＞1 為增效作用，毒性比率＜1 為拮抗作用，毒性比率=1 為相加作用。

預(yù)期抑制生長率（%）=單劑A 的EC50劑量實(shí)際抑制生長率×配比中的百分率+單劑B 的EC50劑量實(shí)際抑制生長率×配比中的百分率

毒性比率=實(shí)際抑制生長率/預(yù)期抑制生長率

1.2.5 復(fù)配劑協(xié)同防治番茄灰霉病菌的盆栽效果測定 為進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)配劑對番茄灰霉病菌的協(xié)同防治效果，2019 年5 月于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)置4 個處理：a，5 mL 50%啶酰菌胺WG 0.081 mg · L-1和5 mL YG-1 1.97 × 108CFU · mL-1的混合液；b，10 mL 50%啶酰菌胺WG 0.081 mg · L-1；c，10 mL YG-1 1.97 × 108CFU · mL-1發(fā)酵液；d，10 mL 清水作為對照。每個處理選取12 盆番茄植株，3 次重復(fù)。選取生長一致的具有3 出復(fù)葉的番茄苗，將4 個處理分別噴灑在番茄葉片上，24 h 后，葉面噴霧接種孢子濃度為1 × 106CFU ·mL-1的番茄灰霉病菌孢子懸浮液。接種后5～7 d調(diào)查發(fā)病水平。番茄灰霉病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，葉片上無病斑；1 級，葉片上病斑1～3 個；3 級，葉片上病斑4～6 個；5 級，葉片上病斑7～10 個；7 級，葉片上病斑11～20 個，部分密集成片。9 級，葉片上病斑密集，占葉片總面積的1/4 以上（王新茹 等，2008；魏繼剛 等，2014；胡文淵，2017）。計算病情指數(shù)，采用SPSS 軟件統(tǒng)計分析防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對番茄灰霉病菌的毒力分析

由表1 可以看出：8 種化學(xué)殺菌劑對番茄灰霉病菌的生長均有較強(qiáng)的抑制作用，但不同殺菌劑對番茄灰霉病菌的生長抑制作用不同，其毒力大小依次為咯菌腈、啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、腐霉利、嘧霉胺、異菌脲、氟啶胺、嘧菌酯。其中咯菌腈、啶酰菌胺對供試菌株菌絲生長的抑制活性較高，其EC50值分別為0.075、0.081 mg · L-1，而嘧菌酯的抑制活性最低，其EC50值為4.357 mg · L-1。咯菌腈、啶酰菌胺在較低濃度下均能有效抑制番茄灰霉病菌的生長，所以選擇咯菌腈和啶酰菌胺進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，測定2 種殺菌劑與熒光假單胞菌YG-1 的生物相容性。

表1 8 種殺菌劑對番茄灰霉病菌的毒力測定

2.2 熒光假單胞菌YG-1 對番茄灰霉病菌的毒力測定

YG-1 熒光假單胞菌菌懸液對番茄灰霉病菌的毒力測定結(jié)果見表2。當(dāng)熒光假單胞菌濃度在1.0 ×105～1.0 × 109CFU · mL-1時，對番茄灰霉病菌的生長均有抑制效果，其抑制率為16.28%～64.56%，抑制中濃度EC50值為1.97 × 108CFU · mL-1。

表2 熒光假單胞菌對番茄灰霉病菌的毒力測定

2.3 熒光假單胞菌與化學(xué)殺菌劑的相容性分析

由表3 可以看出，啶酰菌胺與熒光假單胞菌YG-1 具有較好的生物相容性，當(dāng)啶酰菌胺濃度為50 mg · L-1時，熒光假單胞菌YG-1 能夠正常生長，菌落數(shù)為3.43 × 1010CFU · mL-1，與對照差異不顯著；當(dāng)啶酰菌胺濃度為100 mg · L-1時，YG-1 的菌落數(shù)為2.91 × 1010CFU · mL-1，極顯著低于對照；當(dāng)啶酰菌胺濃度為150 mg · L-1時，YG-1 的菌落數(shù)相比對照也極顯著減少，但仍能達(dá)到2.56 × 1010CFU · mL-1。而當(dāng)咯菌腈的濃度為50～200 mg · L-1時，YG-1 的菌落數(shù)均極顯著低于對照。綜合考慮，由于啶酰菌胺對番茄灰霉病菌的毒力較強(qiáng)，抑制率較高，其EC50值為0.081 mg · L-1，并且與熒光假單胞菌菌株有較好的生物相容性，故選擇啶酰菌胺和生防菌株YG-1 進(jìn)行復(fù)配。

表3 啶酰菌胺和咯菌腈對熒光假單胞菌菌體生長的影響

2.4 啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對番茄灰霉病菌的聯(lián)合毒力

啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對番茄灰霉病菌的聯(lián)合毒力測定結(jié)果見表4，可以看出啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配比例分別為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6 和3∶7（體積比）時，毒性比率分別為1.201 5、1.322 0、1.411 2、1.340 2 和1.284 0，均起到增效作用。其中當(dāng)啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配比為5∶5 時毒性比率最大，具有較好的增效作用。

表4 啶酰菌胺和熒光假單胞菌復(fù)配對番茄灰霉病菌的影響

2.5 啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配對番茄灰霉病菌的盆栽防治效果

將0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU ·mL-1的熒光假單胞菌YG-1 菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配，進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。如表5 所示，啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配對番茄灰霉病的防效較好，且復(fù)配劑中殺菌劑施用量為單劑施用量的一半，其防效為71.31%，極顯著高于單劑啶酰菌胺和熒光假單胞菌YG-1 菌株發(fā)酵液的處理。盆栽試驗(yàn)結(jié)果與室內(nèi)聯(lián)合毒力測定結(jié)果基本一致，當(dāng)0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU · mL-1的熒光假單胞菌YG-1 菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配時，對番茄灰霉病菌的抑制率及對番茄植株灰霉病的防治效果均好于單獨(dú)使用啶酰菌胺或熒光假單胞菌。

表5 番茄灰霉病菌盆栽防治效果分析

3 討論與結(jié)論

番茄灰霉病是影響番茄產(chǎn)量的重要因素（張亞 等，2015），目前番茄灰霉病的防治主要以化學(xué)防治為主（王凌云 等，2012；Shen et al.，2016），但由于灰霉病菌生活周期短、產(chǎn)孢量大、病害傳播快，并且生產(chǎn)中長時間持續(xù)使用單一類型的殺菌藥劑，導(dǎo)致灰霉病菌對多菌靈、異菌脲、乙霉威、嘧菌胺和氟啶胺等常規(guī)殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性（黃海，2014）。通過生防菌株與化學(xué)藥劑的復(fù)配防治植物病害已有一些相關(guān)報道，研究表明生防細(xì)菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌NJ13 分別與嘧菌環(huán)胺和苯醚甲環(huán)唑復(fù)配對人參黑斑病菌的防治達(dá)到增效作用（陳長卿 等，2019）；地衣芽孢桿菌W10 與咪鮮胺復(fù)配可以對桃枝枯病的防治起到增效作用（紀(jì)兆林 等，2019）。而關(guān)于利用生物—化學(xué)策略防治番茄灰霉病的報道卻很少。因此，探索有效利用生防菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治番茄灰霉病的新方法尤為重要。

本試驗(yàn)突破單獨(dú)利用化學(xué)藥劑防治病害的局限性，嘗試采用生防菌與低毒化學(xué)藥劑復(fù)配協(xié)同防治番茄灰霉病，室內(nèi)毒力測定結(jié)果明確了0.081 mg · L-1啶酰菌胺與1.97 × 108CFU · mL-1的熒光假單胞菌菌懸液按5∶5 體積比復(fù)配時，對番茄灰霉病菌的抑制有明顯的增效作用，其盆栽試驗(yàn)防效為71.31%。盡管盆栽試驗(yàn)將啶酰菌胺的施用量減少了一半，但是啶酰菌胺與熒光假單胞菌復(fù)配結(jié)果仍優(yōu)于單獨(dú)使用啶酰菌胺，進(jìn)一步說明生防菌與化學(xué)藥劑的聯(lián)合作用能夠有效地增強(qiáng)防治效果，相對于化學(xué)防治而言，減少了農(nóng)藥的用量及抗藥性的產(chǎn)生，并且使生防菌的防治能力提高、穩(wěn)定性增強(qiáng)，可以達(dá)到減量增效的目的，對番茄灰霉病的防治具有較強(qiáng)的應(yīng)用價值。從化學(xué)藥劑減量的角度，開展生防菌劑與化學(xué)殺菌劑協(xié)同應(yīng)用，一方面為番茄灰霉病化學(xué)藥劑減量防控提供了有效的替代方案，也為后續(xù)相關(guān)復(fù)配劑型的開發(fā)提供了依據(jù)，找到對環(huán)境更為友好的治理方案，通過高效低毒殺菌劑和生防菌的協(xié)同防治達(dá)到理想的防治效果。