混凝土自修復的微生物培養條件研究

沈力安?余汶潞?張彤

摘 要：為培養適用于混凝土自修復的微生物，本研究采用枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、“長安修復菌”對培養條件進行了研究。經過分析，選取37 ℃作為培養溫度，營養物質采用蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂來促進微生物生長。在每1 000 mL培養基中加入錳離子，促進枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌和“長安修復菌”生成芽孢;離心機轉速采用5 000 r·min-1，最終成功培養出高純度的芽孢懸液。

關鍵詞：混凝土;微生物自修復;培養條件;枯草芽孢桿菌;芽孢懸液

中圖分類號：TU528文獻標識碼：A文章編號：1003-5168（2021）05-0088-04

Abstract： In this study， Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria" were used to study the culture conditions. After analysis， 37 ℃ was selected as the culture temperature， and peptone， beef extract powder， sodium chloride and agar were used to promote the growth of microorganisms. Manganese ion was added into every 1 000 mL medium to promote the spore formation of Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria"; the centrifuge speed was 5 000 r·min-1， and finally the high-purity spore suspension was successfully cultivated.

Keywords： concrete;self-healing microorganism;culture condition;bacillus subtilis;spore suspension

近年來，采用微生物誘導礦化的混凝土自修復技術成為國際研究的熱點。微生物自愈合是一種通過微生物自身生命活動與周圍環境介質發生酶化作用并產生方解石等礦物化合物來修復混凝土內部或表面微裂縫的技術。同時，微生物誘導礦化自愈合的過程是一個綠色環保的裂縫修補過程，且可以在一定程度上改善混凝土本身的力學性能。

枯草芽孢桿菌和膠質芽孢桿菌均屬于革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌目前被廣泛應用于微生物自修復混凝土的實驗研究中。枯草芽孢桿菌在土壤和植物微生態中處于優勢地位，繁殖速度快，營養要求簡單，代謝產物也具有很高的酶活性，對大自然環境無污染，也不會危害農作物。作為一種有益的根際微生物，在農業生產及農作物病害預防上發揮了很大作用。目前，枯草芽孢桿菌在生產過程中的主要問題是芽孢的生產率較低，工業化大規模生產條件較為困難，成本較高等。膠質芽孢桿菌是一種廣泛分布于土壤和巖石中的細菌，具有一定的礦物分解能力，能夠分解出礦物中的鉀、硅、磷等元素，同時也具有溶磷、釋鉀和固氮功能，在生長繁殖的過程中產生有機酸等物質。

為確定混凝土用微生物適宜培養條件，本文對枯草芽孢桿菌的生長培養條件進行了優化，引入了膠質芽孢桿菌和在土壤內提取的細菌作為參照，將優化后的培養條件用于三種菌株的培養，并檢查芽孢懸液培養成效。

1 原材料與實驗方法

1.1 微生物

本文所用微生物包括枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌，均由上海保藏生物技術中心提供。另外，從長安大學校園花園苗圃土壤內提取獲得一種潛在細菌，為便于描述，所提取細菌暫命名為“長安修復菌”。

1.2 菌種擴大培養

在超凈工作臺上對上述三類菌種進行擴大培養。主要培養過程：0.5 mL無菌水振蕩，菌體溶液呈懸浮狀，無菌吸管吸出至斜面培養基中，放置于37 ℃恒溫培養箱中進行第一代培養，培養時間為48 h。此后，采用劃線法對第一代菌株擴大培養，得到第二代菌株和第三代菌株。

1.3 菌種芽孢培養

在超凈工作臺中，將第三代菌株劃線培養到促芽孢培養基上，于恒溫培養箱中倒置培養48 h，獲得枯草芽孢桿菌芽孢、膠質芽孢桿菌芽孢、“長安修復菌”芽孢，并通過染色法在顯微鏡下完成芽孢鑒定。

1.4 芽孢懸液制備

用無菌水洗滌促芽孢培養基上的芽孢，并用無菌吸管轉移至離心管中，將離心管放置于離心機內，在5 000 r·min-1轉速下離心30 min，離心后保留下部沉淀部分，重新滴加無菌水并離心，重復以上步驟直至完成3次離心，最終制備出沉淀后的芽孢懸液。

2 微生物篩選與培養參數選擇

2.1 微生物篩選

應用于自修復混凝土中的菌株必須滿足以下條件：①在混凝土內部環境中存活;②具有在水泥基中沉淀碳酸鈣的能力，從而實現在混凝土出現裂縫時表現出足夠的自愈合能力。混凝土的內部環境復雜且具有很多限制因素，例如，pH值高、氧氣濃度較低及混凝土生產時的高溫、高壓及機械應力。因此，篩選的菌株必須是耐高堿性的芽孢，使其可以在極端情況下生存。目前，微生物自修復混凝土主要使用革蘭氏陽性細菌，常見的有芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。

基于此，本研究篩選了枯草芽孢桿菌和膠質芽孢桿菌來復蘇并擴大培養。同時，在長安大學校園花圃中取土壤表層5～10 cm下的肥土100 g左右，把土壤放入無菌采樣袋中帶回實驗室分離、震蕩、密封，通過90 ℃恒溫水浴20 min，篩選出形成芽孢的細菌，制成1∶100濃度的土壤懸液。逐步稀釋，獲得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸液，吸取10-4、10-5、10-6土壤懸濁液0.2 mL，滴加到平板培養基上，于37 ℃恒溫培養1～2 d。從上述平板中分別挑取單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線培養。

挑選顯微鏡下呈桿狀，菌落顏色、形狀、質地、透明度均一致的菌體，進行菌株初步鑒定。挑取疑似芽孢桿菌的菌落，進行稀釋、涂片，通過孔雀綠番紅染色，用顯微鏡觀察革蘭氏染色情況，其中呈紫色的菌體即為革蘭氏陽性菌，并對該菌進一步擴大培養。

2.2 培養溫度

溫度是影響細胞生長代謝的重要因素之一，它會影響各種酶反應的速率，改變菌體代謝產物的合成方向，影響微生物的代謝調控機制和發酵液的理化性質，進而影響發酵的動力學特性和產物的生物合成[1]。

考慮到單因素篩選對培養條件進行優化，因此除溫度這一單一變量外，其他影響菌株生長的因素須保持一致。根據Sibel等學者的優化實驗[2]，控制底物培養基濃度一致，在培養基接種完成后，設置培養溫度為28、31、34、37、40 ℃，在24 h后測定培養皿的OD600nm值。結果表明，當恒溫培養的溫度為37 ℃ 時，菌體的生長量達到最高。溫度高于或低于37 ℃，含菌數都有所下降。因此，本研究采用37 ℃培養溫度對枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌以及“長安修復菌”進行培養。

2.3 氧氣濃度

芽孢桿菌是屬于需氧或者兼性厭氧的細菌，氧氣在芽孢的培養過程中起著非常重要的作用，是影響培養效率的關鍵因素。有效氧濃度的增加，可以促進細菌、孢子和代謝物數量的增加，而有效氧的缺乏或減少，會限制生物的生命活動過程，影響發酵，導致孢子囊的溶解。根據Elsayed等的研究結果可知，枯草芽孢桿菌在限制氧氣的條件下不會產生孢子，而在通氣量為2 L/min時產芽孢量最高[3]。

2.4 培養基配方篩選

促進枯草芽孢桿菌產生芽孢的培養基應該由碳源、氮源、無機鹽、生長因子和滿足細菌代謝所需要的附加物質組成，且這些組成物質相互作用，在不同情況下對最終細菌孢子的產量具有不同程度的影響，所以促芽孢培養基需要營養物質的不同組合來優化和培養芽孢桿菌孢子。

不同種類和數量的碳氮源對枯草芽孢桿菌有著不同的影響。根據Elsayed等人的研究可知，20 g·L-1葡萄糖、2.5 g·L-1硫酸銨條件下枯草芽孢桿菌孢子濃度達到最大。Kardziani等人發現，培養基中葡萄糖濃度為2 g·L-1時孢子產量最高，較高的葡萄糖濃度會抑制產孢。Chen等人使用10種不同的碳氮源來探究產芽孢量的關鍵營養來源，發現利用玉米淀粉、麥麩、玉米粉、玉米漿、大豆粉和酵母提取物等制備的營養成分可高效生產枯草芽孢桿菌。

無機鹽和微量元素等營養物質是枯草芽孢桿菌產生芽孢的關鍵條件，不同類型的無機鹽對菌體生長和出芽的影響程度也不一樣。在維生素和微量元素的影響下，枯草芽孢桿菌產生孢子的效果更好[3]。錳離子是芽孢形成的關鍵微量元素，郭夏雨通過實驗發現，當Mn2+的濃度為2.4 mmol·L-1時，芽孢數量達到最高，隨著Mn2+不斷增加，芽孢數量逐漸減少，當Mn2+濃度為6 mmol·L-1時，幾乎不能產生芽孢。雖然錳離子對芽孢的形成有顯著的作用，但是錳離子對于細菌增殖沒有明顯作用[4]。

細菌和芽孢的生長都需要一個相對合適的酸堿度環境，而大部分菌體都能在中性環境下正常生長。pH值一方面可以影響細胞膜的電荷，引起原生質膜對個別離子透性的變化，同時也會影響微生物對營養物質的吸收、酶的形成等。研究表明，最適合枯草芽孢桿菌芽孢生長的pH值為7.0，且隨著pH的不斷增加，細菌數量和芽孢數量會不斷下降。

根據上文分析，本實驗的菌種最適宜的培養基組成是：玉米漿16.18 g·L-1、大豆粉17.53 g·L-1、酵母膏8.14 g·L-1、 （K2HPO4+KH2PO4）0.5 g·L-1，MnSO4·H20 0.2 g·L-1;產芽孢的底料初始pH值為7.0。

2.5 離心機轉速

當對枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、“長安修復菌”培養三代之后，將對其進行芽孢培養，制作芽孢懸液。在制作芽孢懸液前，需要多次對枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌及“長安修復菌”進行無菌水洗滌沖洗和離心。然而，離心機轉速的大小會影響芽孢的離心狀態。根據趙甜宇等的實驗研究可知，在優化制備菌劑的工藝時均采用5 000 r·min-1的轉速來離心菌液，能成功得到離心良好的菌泥[5]。因此，本研究選擇離心機轉速為5 000 r·min-1。

3 研究結果

3.1 微生物擴大培養結果

培養流程如圖1所示，第一、二、三代為在37 ℃培養溫度下，以蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂為營養物質，培養后可觀察到培養皿內已有大量微生物長出且生長狀況良好。可見，37 ℃培養溫度及此類營養物質非常適合枯草芽孢桿菌的生長。

圖2為在校園土壤內提取微生物的樣品。用無菌設備對花壇下的土壤進行取樣，并制備土壤懸液，對土壤懸液進行梯度稀釋后，獲得分別稀釋10-4、10-5、10-6后的液體，并對其進行涂布培養。其中，稀釋[10-6]的土壤懸液單菌落分離，平板培養基內生長出了4個微生物。如圖3所示，A、B、C分別為枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌及“長安修復菌”。其中，“長安修復菌”為挑選的疑似芽孢桿菌的菌落，通過革蘭氏鑒定，菌體呈紫色。

3.2 芽孢鑒定

圖4為在促芽孢培養基中提取的少量芽孢染色后的顯微鏡觀察圖，A、B、C分別為枯草芽孢桿菌芽孢、膠質芽孢桿菌芽孢和“長安修復菌”芽孢。通過觀察可發現，培養基中含有大量綠色顆粒及少許紫色顆粒，綠色顆粒即生成的芽孢，而紫色顆粒則為未生成芽孢的微生物。可見，芽孢培養基中的營養物質配比可以有效促進枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌和“長安修復菌”生成芽孢且芽孢生成率較高。

3.3 芽孢培養結果

圖5中A、B、C分別為離心后的枯草芽孢桿菌芽孢懸液、膠質芽孢桿菌芽孢懸液和“長安修復菌”芽孢懸液。可見，在5 000 r·min-1轉速下離心30 min可以有效去除雜質且芽孢均離心密實，表明該轉速下可以離心得到較高純度的枯草芽孢桿菌芽孢。

4 結論

結果表明，本研究確定的37 ℃培養溫度、營養物質組成（蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂）適宜枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌和“長安修復菌”生長。同時，以玉米漿、大豆粉、酵母膏為營養物質并加入一定量（K2HPO4+KH2PO4）、MnSO4·H20制成的促芽孢培養基順利地制備了枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌和“長安修復菌”芽孢。采用5 000 r·min-1的離心轉速，順利實現了三類微生物的芽孢提純。

參考文獻：

[1]上官文菲，陳合，陳婧，等.響應面法優化發酵乳桿菌產γ-氨基丁酸的培養條件[J].中國釀造，2019（12）：87-91.

[2] UZUNER S ， CEKMECELIOGLU D . Enhanced pectinase production by optimizing fermentation conditions of Bacillus subtilis growing on hazelnut shell hydrolyzate[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2015（1）：62-67.

[3] MONTEIRO S，CLEMENTE J J，CARRONDO M， et al. Enhanced Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium[J].Advances in Microbiology，2014（8）：444-454.

[4]郭夏麗，狄源寧，王巖.枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優化[J].中國土壤與肥料，2012（3）：99-103.

[5]趙甜宇，潘朝陽，張朝輝，等.固態枯草芽孢桿菌菌劑的制備工藝研究[J].食品工業科技，2020（19）：104-111，120.