植物乳膠蛋白研究進展

王雷 孫堯 李瑤 孫鑫 吳瓊 曹滌非 黃國慶 薛佳瑩

摘要 乳膠蛋白（MLP）是植物特有的一類蛋白質(zhì)，目前人們已經(jīng)從多種植物中發(fā)現(xiàn)MLP，并克隆獲得了MLP基因，對其功能也進行了研究。MLP在植物生長發(fā)育、抵御生物脅迫和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。對植物MLP的理化性質(zhì)、結構特點，以及MLP在植物生長發(fā)育、生物脅迫與非生物脅迫應答中的作用進行闡述，為MLP功能研究及其在植物分子育種方面的應用提供參考。

關鍵詞 乳膠蛋白;理化性質(zhì);結構特點;生長發(fā)育;生物脅迫;非生物脅迫

中圖分類號 S188;Q789? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）10-0012-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress of Plant Major Latex Protein

WANG Lei，SUN Yao，LI Yao et al （Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001）

Abstract Major latex proteins are special proteins in plant.Many MLP genes have been found and cloned from plants and the functions of MLP have been characterized.MLP plays an important role in the process of plant growth and development，resisting biotic and abiotic stresses.This article described the physical and chemical properties and structural characteristics of plant MLP，as well as the role of MLP in plant growth and development，biotic and abiotic stress responses，and provided the references for the study of MLP functions and its application in plant molecular breeding.

Key words Major latex protein;Physical and chemical properties;Structural characteristics;Growth and development;Biotic stress;Abiotic stress

鹽堿、高溫、低溫、病害、蟲害等都是制約植物生長和發(fā)育的重要因子，探明植物的抗逆機制、培育抗逆性強的作物新品種已成為農(nóng)林科學研究的熱點[1-2]。植物遭受逆境脅迫時，體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化變化以適應逆境條件[3-4]，一些與抗逆相關的基因也會大量表達，用于感應和傳導逆境脅迫的信號和適應脅迫環(huán)境[5]。乳膠蛋白（major latex protein，MLP）是植物特有的一類蛋白質(zhì)。自1985年，Nessler等[6]從罌粟的乳膠中獲得乳膠蛋白以來，隨著多種植物全基因組測序的完成和生物信息學分析技術的發(fā)展，已從陸地棉[7]、擬南芥[8]、桃[9]等植物中獲得MLP基因，這些基因在植物生長發(fā)育、抵抗生物脅迫與非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。筆者對植物乳膠蛋白（MLP）的理化性質(zhì)、結構特點，以及MLP在植物生長發(fā)育、生物脅迫、非生物脅迫過程中的作用進行論述，以期為MLP基因在作物抗逆分子育種中的應用提供理論參考。

1 植物乳膠蛋白的理化性質(zhì)和結構特點

1.1 理化性質(zhì) 1985年，Nessler等[6]從罌粟的乳膠中提取蛋白，并進行SDS-PAGE電泳，首次發(fā)現(xiàn)2條特異性的乳膠蛋白條帶，分子量約為20? kD，等電點pI為3.5～6.0。隨著生物技術的飛速發(fā)展，目前已經(jīng)從多種植物中獲得了MLP蛋白。不同物種的MLP蛋白或同一物種MLP不同亞家族成員之間，MLP蛋白分子量和等電點差異較大。Yuan等[10]對蘋果中36個MLP蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白是由116～252個氨基酸組成，分子量為12.76～28.16 kD，等電點pI為4.61～9.37。韓淑梅等[11]利用生物信息學方法對桑樹乳膠蛋白MLX56家族的3個成員MLX56-5、MLX56-6和MLX56-7進行分析，結果顯示，MLX56-5、MLX56-6和MLX56-7分別由392、415和372個氨基酸組成，分子量分別為43.01、45.09和41.33 kD，等電點pI分別為7.44、6.57和5.30。Zhang等[12]對葡萄中14個MLP進行分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白是由151～224個氨基酸組成，分子量為16.75～18.21 kD，等電點pI為5.05～6.67。

1.2 結構特點

MLP屬于Bet v1 （Betula verrucosa，Bet v） 蛋白超家族，含有Bet v1過敏原結構域[13-14]。Bet v1 超家族可以分為11個亞家族，包括MLP乳膠蛋白、病程相關蛋白PR10 （pathogenesis related 10，PR10）[15-16]、細胞分裂素特異結合蛋白 （cytokinin specific binding protein，CSBP）[17]等。MLP基因數(shù)量與物種基因組大小無關。MLP蛋白含有保守序列motif 1、motif 2、motif 3。根據(jù)motif的數(shù)量和組成的不同，MLP蛋白可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞家族，其中MLP家族I包括motif 1、motif 2、motif 3保守序列，MLP家族Ⅱ只包括motif 1保守序列，MLP家族Ⅲ只包括motif 2保守序列。MLP 蛋白均具有Y-shaped cavity結構。例如，MLP和病程相關蛋白PR10氨基酸序列同源性低于25%，但是它們卻有相同的Y-shaped cavity結構[18]，該結構在與配體結合的過程中發(fā)揮重要作用。Lytle等[19]利用核磁共振和X射線晶體衍射的方法解析了擬南芥中2種MLP的結構，發(fā)現(xiàn)擬南芥MLP含有helix-grip 結構，包括6個β折疊和C-端的1個α螺旋。在 β 折疊和長的 α 螺旋二級結構元件之間形成一個大的 Y-shaped cavity結構，該結構可以結合一些植物激素，參與植物應激反應。植物MLP另一個結構特點是在第1個α螺旋與第2個β折疊之間有一段無規(guī)則卷曲，該序列富含甘氨酸 （Gly），保守序列為GXXXXXG，稱為Gly-rich loop，該序列與配體識別和結合密切相關，也有研究發(fā)現(xiàn)Gly-rich loop序列定點突變會對植物抗逆性產(chǎn)生影響[20]。

2 MLP在植物生長發(fā)育過程中的作用

MLP在植物營養(yǎng)生長過程中發(fā)揮重要作用。Litholdo等[21]利用RNA干擾技術抑制擬南芥MLP423基因的表達，mlp423突變體植株表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷，包括葉形態(tài)的改變、莖尖異常分化、植株過早死亡等;雙分子熒光（bimolecular fluorescence complementation，BiFC） 試驗證明擬南芥MLP423可與葉卷曲蛋白LCR F-Box發(fā)生相互作用，LCR F-Box可以引起乳膠蛋白MLP423 的降解。順式肉桂酸是植物自身合成的一類次生代謝產(chǎn)物，與植物生長調(diào)控密切相關。Guo等[22]對正常生長條件下和外施順式肉桂酸條件下的擬南芥進行蛋白質(zhì)組學研究，結果發(fā)現(xiàn)順式肉桂酸可以誘導擬南芥中2個編碼MLP的基因ZCE1 （AT2G01520）和ZCE2 （AT2G01530）表達，實時定量PCR的結果也證明外施順式肉桂酸可以提高上述2個基因在轉錄水平的表達量。為進一步研究MLP在植物生長中的作用，利用RNA干擾技術獲得MLP基因功能缺失的擬南芥突變體，zce1突變體植株出現(xiàn)生長緩慢、提早抽薹的表型。上述結果表明，擬南芥乳膠蛋白ZCE1可以促進擬南芥營養(yǎng)生長，延遲擬南芥開花。

花的發(fā)育對于植物生長發(fā)育以及繁衍后代具有重要意義，MLP在花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Ruperti等[23]從桃樹中克隆獲得PpMLP基因，該基因在花和果實中的表達量高于根、莖、葉，在果實細胞增殖過程中其表達量不斷升高，表明PpMLP基因與花和果實發(fā)育密切相關。Ando等[24]利用焦磷酸測序技術對黃瓜果實細胞擴增過程中的轉錄組進行測序，在基因高表達的聚類里發(fā)現(xiàn)MLP基因，進一步研究表明隨著果實不斷膨脹，MLP基因表達量不斷升高。

3 MLP在植物抵御逆境脅迫過程中的作用

3.1 MLP在生物脅迫應答中的功能

植物在生長發(fā)育過程中常會遭受病害、蟲害等生物脅迫的傷害，在長期的進化過程中，植物建立了完整的體系以適應多變的環(huán)境。植物可以通過自身形態(tài)結構的變化、分泌化學物質(zhì)等方式來阻止病原微生物的進入和擴散。另外，植物通過先天免疫和局部感染引起的獲得性免疫信號來抵抗病原菌的侵染[25-26]。MLP 家族蛋白基因能被病原菌侵染所誘導表達。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，黃萎病可誘導棉花根部MLP基因的表達，并且MLP基因上游啟動子中含有真菌誘導子;MLP通過三維結構的Y-shape cavity與配體結合或者運輸，從而參與到生物脅迫的防御反應中。Yang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，GhMLP28基因在陸地棉根、莖、葉中均表達，當引起陸地棉黃萎病的大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）進入植物體后，GhMLP28基因在根部的表達量顯著提高，并且外施乙烯和茉莉酸，也可以促進GhMLP28基因的表達，表明GhMLP28基因參與大麗輪枝菌引起的防御反應。通過病毒誘導使得GhMLP28基因沉默，抑制表達的轉基因陸地棉對黃萎病敏感，而過量表達的轉GhMLP28基因煙草對黃萎病的抗性顯著提高。酵母雙雜交和Pull-down試驗均證明GhMLP28可與GhERF發(fā)生相互作用，二者互作可以促進GhERF與順式元件GCC-box的結合。瞬時表達試驗結果也證明，GhMLP28與GhERF互作，增強GhERF轉錄活性。GhMLP28定位在細胞核和細胞質(zhì)中，當GhERF存在時，GhMLP28在細胞核中累積，推測GhMLP28間接地參與轉錄調(diào)控。Song等[29]研究了煙草中MLP28的功能，發(fā)現(xiàn)NbMLP28在煙草抵御馬鈴薯病毒Y （potato virus Y，PVY）感染過程中發(fā)揮重要作用。NbMLP28定位于原生質(zhì)膜和細胞核上，在根中的表達量最高。PVY病毒侵染煙草，可以誘導NbMLP28基因表達，并參與茉莉酸信號轉導途徑。NbMLP28基因沉默的煙草株系表現(xiàn)出對馬鈴薯病毒Y的敏感性，NbMLP28基因過量表達的煙草植株則表現(xiàn)出對馬鈴薯病毒Y的抗性。He等[30]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdMLP423基因主要在花中表達，在霜霉菌和鏈孢霉菌侵染下，蘋果MdMLP423基因表達受到抑制。MdMLP423基因過表達的轉基因蘋果中，抗逆相關基因表達量降低，轉基因株系表現(xiàn)出對霜霉菌和鏈孢霉菌的敏感性。

3.2 MLP在非生物脅迫應答中的功能

在干旱、鹽堿、低溫、高溫、機械損傷等非生物脅迫條件下，植物生長緩慢、發(fā)育遲緩、代謝紊亂、光合作用受到抑制，嚴重時甚至死亡。植物非生物脅迫的應答體現(xiàn)為其體內(nèi)生理生化的變化，這是由植物中大量與抗逆相關基因的表達水平發(fā)生變化而引起的[31-32]。在植物中，非生物應答的相關分子可分為兩類：一類為效應分子，直接參與代謝變化等生化應答過程，產(chǎn)生抗逆效應。效應分子包括參與非生物脅迫下重建細胞離子平衡、滲透壓平衡、水分攝取平衡的各種蛋白分子，如滲透劑合成酶類、各種通道蛋白[33]。另一類為調(diào)控分子，位于效應分子上游，介導信號傳遞，包括轉錄因子和信號級聯(lián)系統(tǒng)中的各種激酶[34-36]。MLP在非生物脅迫條件下的功能還不十分清楚。Sun等[37]從人參葉片中克隆獲得MLP151基因，全長cDNA序列850 bp，ORF區(qū)456 bp，編碼151個氨基酸，理論等電點4.86，分子量16.87 kD;利用RT-PCR的方法對NaCl、甘露醇、H2O2、茉莉酸、紫外照射、低溫脅迫條件下該基因在人參根、莖、葉、花芽中的表達情況進行檢測，結果表明不同的組織中MLP151基因表達量差異不顯著;但是不同的脅迫條件下，MLP151基因的表達量有變化;在甘露醇脅迫下，葉片中MLP151基因表達量升高;NaCl、UV、低溫脅迫下，MLP151基因表達量與脅迫前差異不顯著;茉莉酸和H2O2脅迫下，MLP151基因表達量降低。Wang等[38]對干旱脅迫下擬南芥MLP43基因的功能進行研究，MLP43基因在子葉、初生根、頂端分生組織中表達量較高，在根、莖、葉中則呈現(xiàn)低水平表達;亞細胞定位顯示MLP43定位在細胞核和細胞質(zhì)中，同時MLP43基因過量表達的轉基因株系在干旱脅迫下的失水率、電解質(zhì)滲出率低于野生型，SOD活性則顯著高于野生型;酵母雙雜交試驗結果顯示MLP43與ABA信號轉導途徑中SnRK2.6和ABF1互作。上述結果表明，MLP43參與擬南芥干旱應答和ABA信號轉導途徑。李欣欣等[39]在蘋果基因組中鑒定出13個MLP基因，這些基因在蘋果的根、莖、葉、花梗、果皮、花托、花瓣、柱頭、花萼、花藥、花絲、種子、幼果、果肉14個組織器官中存在差異表達。在ABA、NaCl、PEG脅迫條件下， MdMLP基因表達量均升高;在40 ℃脅迫條件下，MdMLP基因表達量均下調(diào);在4 ℃脅迫下除MdMLP1/6/7/11 之外，MdMLP基因表達量均下降。以擬南芥為參考物種，利用String 蛋白數(shù)據(jù)庫對MdMLP 互作蛋白進行預測，結果表明MdMLP 可能通過與PRSP、SNRK1/2、bHLH 等應激、ABA相關轉錄因子互作，參與蘋果對非生物脅迫的應激反應。MLP蛋白在植物吸附有機污染物中發(fā)揮重要作用，Inui等[40]研究發(fā)現(xiàn)葫蘆科植物西葫蘆的木質(zhì)部中MLP蛋白對疏水性有機污染物有很強的吸附作用，MLP蛋白對于利用葫蘆科植物對有機廢物進行植物修復具有重要意義。

4 展望

綜上所述，目前人們已從陸地棉、擬南芥、葡萄等植物中克隆獲得MLP基因，也證明MLP在植物生長發(fā)育、抵抗生物脅迫與非生物脅迫過程中發(fā)揮一定的作用，但是MLP功能和作用機理仍然不清楚。生物脅迫和非生物脅迫條件下，植物激素水平發(fā)生變化，MLP存在激素結合位點，但是MLP與哪些激素結合、參與哪些信號轉導途徑、如何提高植物抗逆性都未研究清楚。另外，MLP家族成員均有Y-shaped cavity結構，該結構的作用是什么、是否與植物生長發(fā)育和抗逆性相關都有待于進一步研究。未來工作中，可以在上述領域開展深入研究。對MLP生物學功能的研究，對MLP基因在植物抗逆分子育種中的應用具有重要的意義。

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