革蘭氏陽性與陰性細菌基因組DNA提取方法的優化

云飛 梁林 鮑彥彬 石雅麗 孫亞超 李永麗 蘭輝

摘要 在分析現有提取微生物基因組DNA的原理和方法基礎上，對SDS-NaCl法進行了改良，以商品化微生物基因組提取試劑盒提取的基因組結果為對照，利用改良的SDS-NaCl法，分別提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA。結果表明，改良的SDS-NaCl法提取的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的 OD260/OD280分別為1.88、1.89、1.81，濃度分別為61.67、64.32、53.22 μg/mL;而商品化試劑盒提取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA OD260/OD280分別為1.85、1.87、1.83，濃度分別為64.07、58.43 、52.34 μg/mL。結果證明改良SDS-NaCl法提取的革蘭氏陽性和陰性細菌的基因組DNA可用于后續試驗如全基因組測序和PCR等，同時可快速獲得大量的高質量微生物基因組。

關鍵詞 細菌基因組DNA;革蘭氏陽性細菌;革蘭氏陰性細菌;SDS-NaCl法

中圖分類號 Q933文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）10-0098-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Methods for Genomic DNA Extraction from Bacteria

YUNFei1，LIANG Lin2，BAO Yan-bin2 et al

（1. Department of Mining Technology， Inner Mongolia University of Technology， Hohhot， Inner Mongolia 010051;2. School of Chemical Engineering and Technology， Inner Mongolia University of Technology， Hohhot， Inner Mongolia010051）

Abstract Based on the analysis of the principles and methods of genomic DNA extraction， the SDS-NaCl method was modified. The results of genomic DNA extraction by commercial genomic extraction kit were compared with those by SDS-NaCl method modified by our laboratory. The results showed that the OD260/OD280 of the genomic DNA of Escherichia coli， Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were 1.88， 1.89 and 1.81， and the concentration were 61.67，64.32and 53.22 μg/mL respectively.The OD260/OD280 by commercial genomic extraction kit were 1.85， 1.87 and 1.83， and the concentration were 64.07，58.43 and 52.34 μg/mL respectively. The results showed that the genomic DNA extracted by the modified nacl method could be used in subsequent experiments such as whole genome sequencing and PCR， and a large number of high quality microbial genomes could be obtained rapidly.

Key words Genomic DNA;Gram positive bacterium;Gram negative bacterium;SDS-NaCl method

目前，隨著高通量測序技術日益成熟，微生物全基因組DNA的完成圖測序和重測序已成為微生物分子生物學與代謝組學研究中的重要手段，其中微生物基因組DNA的質量對測序結果影響很大。

目前，提取微生物基因組DNA的方法主要有液氮研磨法[1-4]、凍融法[5]、加熱煮沸法[6]、堿裂解法、溶菌酶法[7-9]、SDS（十二烷基磺酸鈉）法[6，10]、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[10]、Chelex-100煮沸法[11]、吸附柱法[12]、磁珠法[13-14]。

SDS-NaCl法具有裂解細菌徹底和提取基因組DNA純度較好的特點。筆者利用改良的SDS-NaCl法，分別提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA（其中大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌），同時以商品化細菌基因組提取試劑盒提取結果為對照，通過與商品化試劑盒提取效果進行比較，獲得一種操作簡單、成本低廉，且可快速獲得較高質量的革蘭氏陽性和陰性細菌的基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種來自內蒙古工業大學基因工程實驗室保存的大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

細菌基因組DNA提取試劑盒購買于北京天根生化科技有限公司。蛋白酶K、溶菌酶、SDS、苯酚、氯仿和無水乙醇均為國產試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 商品化試劑盒的提取。

提取步驟參見北京天根生化科技有限公司細菌基因組DNA試劑盒說明書。

1.2.2 改良的SDS-NaCl法。

將細菌在LB培養基中（酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，1 000 mL去離子水，用5 mol/L的NaOH調節其pH至7.0，121 ℃蒸汽滅菌20 min）培養8～10 h后，取1 mL新鮮菌液放入離心管，10 000 r/min離心1 min后盡可能除凈上清;加入200 μL溶菌酶，懸浮菌體;加入10 μL RNaseA輕輕混勻;加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），室溫靜置1 min;然后加入500μL的裂解液（100 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl，500 mmol/L pH 8.0 EDTA，20 mmol/L NaCl，10%SDS），50 ℃溫浴20 min;加入300 μL的苯酚，上下混勻;再加入氯仿300 μL，混勻;10 000 r/min，5 min;轉移上清液至新離心管;加入300 μL的氯仿，混勻，離心10 000 r/min，5 min，轉移上清液到新離心管;加入1 mL無水乙醇，在-20 ℃中沉淀10 min;離心10 000 r/min，15 min，棄上清液;加入1 mL 70%的乙醇洗滌，離心10 000 r/min，5 min，棄上清液;在室溫下干燥15 min;然后加入30 μL ddH2O。取1 μL DNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，同時通過紫外分光光度計檢測濃度。

2 結果與分析

2.1 商品化試劑盒提取的3種細菌基因組DNA

利用商品化試劑盒提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA，經凝膠電泳后檢測DNA的質量，結果見圖1。從圖1可以看出，3種細菌的基因組DNA經電泳后條帶整齊清晰，無蛋白和RNA殘留，DNA質量較好。

2.2 改良SDS-NaCl法提取的3種細菌基因組DNA

利用改良SDS-NaCl法提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的基因組DNA，經凝膠電泳后檢測DNA的質量，結果見圖2。從圖2可以看出，3種細菌的基因組DNA經電泳后條帶整齊清晰，與商品化試劑盒提取結果相比，DNA條帶較

粗，說明改良SDS-NaCl法提取DNA的量更多，DNA的質量更好。

2.3 基因組DNA 的濃度及純度

根據紫外分光光度法結果（表1）分析這2種方法提取細菌基因組DNA的質量，商品化試劑盒法提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組DNA的OD260/OD280分別是1.85、1.87和1.83，OD260/OD230分別是2.06、1.94和2.02，濃度分別是64.07、58.43和52.34 ng/mL;改良SDS法提取的大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組DNA的OD260/OD280分別是1.88、1.89和1.81，濃度分別是61.67、64.32和53.22 ng/mL。結果表明，經改良的SDS 法提取的3種細菌基因組 DNA 純度和濃度均較好（圖3），且操作步驟簡單，成本低，可用于大量提取細菌基因組DNA。

3 結論

微生物基因組提取是進行微生物分子生物學與代謝分析的基本操作，基因組的質量與數量直接影響下游試驗的結果，因此根據試驗樣品的特點對微生物基因組提取方法進行不斷改良是必需的，這樣可以有效提高試驗結果的準確性與可信度。如對于特殊環境微生物基因組的提取，如瘤胃微生物等，就必須對試驗方法進行改良。該研究將目前常用的微生物基因組提取方法進行比較，同時將革蘭氏陽性細菌與陰性細菌的基因組提取特點進行比較，以便今后對于特殊環境微生物基因組進行提取方法的摸索與改良。

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