對硫磷等6種農藥殘留熒光免疫檢測芯片的研發及應用

□王兆芹 汪彤 崔海峰 趙正苗 萬宇平（通信作者）北京勤邦生物技術有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心

□ 索金玉 灤州市農業農村局

引言

有機磷類農藥與菊酯類農藥是蔬菜與水果中常用的兩大類農藥——對硫磷、毒死蜱、辛硫磷是有機磷類農藥中的典型代表，甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯則是菊酯類農藥中的典型代表，這兩類農藥常常交替使用以降低害蟲產生抗藥性的幾率。然而，農藥可經消化道、呼吸道及完整的皮膚和粘膜進入人體，從而對身體產生危害。因此，檢測果蔬產品中的對硫磷等有機磷類農藥和甲氰菊酯等菊酯類農藥具有必要性。

目前，檢測有機磷類農藥和菊酯類農藥的方法主要包括氣相色譜-串聯質譜法[1-4]、氣相色譜[5-8]、高效液相色譜法[9-11]、超高效液相色譜[12]、液相色譜法[13]等儀器方法，但此類方法的成本較高、用時較長，免疫化學檢測法則具有低成本、用時較短、特異性較強等優點[14-15]。本文制備出一種能夠同時檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條——消耗費用及檢測時限均能夠滿足基層實驗室的檢測需求，故具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質研究中心；抗體、包被原、羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀，由北京勤邦生物技術有限公司提供；時間分辨熒光微球，購自蘇州為度生物技術有限公司；渦旋儀，購自湖南湘立科學儀器有限公司[14-15]。

1.2 方法

1.2.1 制備對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等藥物的抗體分別用熒光微球標記，將標記物分別噴涂到試紙條的核心結構熒光免疫檢測芯片上，即在檢測線1（T1線）上包被對硫磷包被原、在檢測線2（T2線）上包被毒死蜱包被原、在檢測線3（T3線）上包被辛硫磷包被原、在檢測線4（T4線）上包被甲氰菊酯包被原、在檢測線5（T5線）上包被氯氰菊酯包被原、在檢測線6（T6線）上包被溴氰菊酯包被原，在質控線（C線）上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結構，制備出對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條。

1.2.2 檢測方法

用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔中，當液體流動時開始計時，反應5min時通過熒光分析儀讀取檢測結果，其它時間判讀無效。

1.2.3 樣本檢測限

在空白柑橘、空白白菜樣本中添加對硫磷標準品至質量濃度為0、0.01、0.02、0.04ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加毒死蜱標準品至質量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加辛硫磷標準品至質量濃度為0、5、10、20 ppm；在空白柑橘樣本中添加甲氰菊酯標準品至質量濃度為0、2.5、5、10ppm，在空白白菜樣本中添加甲氰菊酯標準品至質量濃度為0、0.5、1、2ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加氯氰菊酯標準品至質量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm；在空白柑橘樣本中添加溴氰菊酯標準品至質量濃度為0、0.05、0.1、0.2ppm，在空白白菜樣本中添加溴氰菊酯標準品至質量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm。按照“1.2.2”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定樣本檢測限[14-15]。

1.2.4 試紙條的特異性

分別配制10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，用試紙條重復檢測3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.5 試紙條的準確性

農業部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準確性[14-15]。取經儀器確證的50份陰性果蔬樣品（質量濃度小于檢測限）與50份陽性果蔬樣品（質量濃度大于檢測限），用該試紙條檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的藥物殘留量，計算假陽性率和假陰性率[14-15]。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零[14-15]。

2 結果與分析

2.1 樣本檢測限

按照“1.2.3”在空白樣本中添加藥物標準品至一定的質量濃度，進行檢測，并確定檢測限[14-15]。

2.2 特異性

采用該試紙條檢測10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，結果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低于5%；用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品，試紙條檢測結果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》的要求[14-15]。

3 討論

本文制備出試紙條的核心結構——熒光免疫檢測芯片，研制出一種能夠同時檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》的要求對試紙條進行了特異性、準確性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為5min，比現有文獻中的儀器方法用時更短，操作更簡便。試紙條的對硫磷檢測限為果蔬0.02mg/kg，毒死蜱檢測限為果蔬0.5mg/kg，辛硫磷檢測限為果蔬10mg/kg，甲氰菊酯檢測限為水果5mg/kg、蔬菜1mg/kg，氯氰菊酯檢測限為果蔬0.5mg/kg，溴氰菊酯檢測限為水果0.1mg/kg、蔬菜0.5mg/kg，靈敏度較高。

表1 對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯六合一試紙條的檢測限

表2 特異性測定