水族藥雞胚質量控制方法的初步研究*

劉春花， 游景瑞,， 王愛民， 王永林， 陳旭利， 馬雪， 鄭林， 李勇軍**

(1. 貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025； 3. 貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4. 貴州水族藥物開發有限責任公司， 貴州 黔南布依族苗族自治州 558100)

雞胚為雉科動物家雞(GallusgallusdomesticusBrisson)干燥胚胎，是水族常用民間藥物，其用藥史最早可追溯到清朝的中后期，在貴州省黔南州水族民間用藥已有100多年的歷史，廣泛流傳于貴州省黔南州南部地區。雞胚味甘、咸、腥，性溫，歸脾、胃經，用于體虛贏瘦、骨折、筋傷疼痛等，有溫中益氣、補精填髓的功效[1-2]。按照水族醫藥理論，以血肉之品補益肌肉骨骼，據《水族骨傷醫藥》中記載，小雞仔具有療傷生肌的作用，為水族骨傷醫藥的常用接骨藥物[3-5]，現代研究也報道雞胚參與的方藥在治療骨傷方面具有較好的療效[5-10]。目前關于雞胚的質量控制標準較少，限制了其廣泛的應用和開發，因此本研究通過對雞胚藥材的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、檢查(水分、總灰分、揮發性鹽基氮)及醇溶性浸出物等項目進行研究，初步建立雞胚質量控制方法，為完善雞胚的質量標準提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料與儀器 超聲波清洗儀(上海躍進醫用光學器械廠)、XTP-A500多功能粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、WP-MP-II-20實驗室超純水機(四川沃特爾科技發展有限公司)、青島海洋硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)、煙臺黃海江友硅膠G板(煙臺黃海江友化工廠)、青島鼎康硅膠G板(青島鼎康化工廠)、尼康50i顯微鏡及DS-Fi2成像系統(日本尼康公司)、REPROSTAR3薄層數碼成像系統(瑞士CAMAG公司)、DK-98-Ⅱ型水浴鍋和DH600BII恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.1.2試藥 雞胚為家雞蛋經(37.9±0.5)℃孵化17～18 d除去蛋殼的胚胎，新鮮胚胎示意圖見圖1。本研究所用雞胚樣品均由貴州省農業科學院提供，批號分別為20160929、20161124及20170302，樣品均由貴州醫科大學藥學院中藥民族藥標本館龍慶德副教授鑒定為雉科動物家雞CallusgallusdomesticusBrisson干燥胚胎，憑證標本存放于貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室。取雞胚(批號20170302)為對照藥材。無水乙醇、95%乙醇、甲醇、水合氯醛、硼酸、碳酸鉀、甘油及溴甲酚綠指示劑(國藥集團化學試劑有限公司)，三氯甲烷、冰醋酸、丙酮、正丁醇(上海試四赫維化工公司)，茚三酮、甲基紅指示劑(上海馨晟試化工科技有限公司)，丙三醇購(天津市致遠化學試劑有限公司)，阿拉伯樹膠(天津市科密歐化學試劑有限公司)，鹽酸(重慶川東化工(集團)有限公司)，無水碳酸鈉基準試劑(天津市化學試劑研究所有限公司)，以上試劑均為分析純。

圖1 新鮮雞胚

1.2 方法

1.2.1性狀鑒別 采用直尺和游標卡尺對干燥雞胚藥材的大小進行測量并取平均值，采用看、摸、聞及嘗等直觀方法對樣品的形狀、色澤、表面、質地、斷面及氣味等進行鑒定。

1.2.2顯微鑒別 取上述3批雞胚藥材分別粉碎(過4號篩)，得粉末。挑取少許雞胚藥材粉末置于載玻片上，滴加蒸餾水、水合氯醛試液或稀甘油試液等(必要時加熱進行透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下(40×10)觀察、測量和拍照。

1.2.3薄層色譜鑒別 取雞胚藥材粉末(過3號篩)1 g，加入70%乙醇溶液10 mL，40 kHZ超聲20 min，濾過，收集濾液，即得供試品溶液；另取雞胚對照藥材1 g，同法操作，制備對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部[11]通則0502試驗，分別精密吸取上述供試品及對照藥材溶液各10 μL，點于同一塊硅膠G板上，點成條帶狀，用正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶3 ∶2)作為展開劑，進行展開，然后取出硅膠板晾干，用茚三酮試液緩慢噴灑在硅膠板上，將硅膠板置于105 ℃下加熱，顯色，直至條帶顯色清晰，于日光下檢視，拍照。

1.2.4水分測定 參照《中國藥典》2015年版四部[11]通則0832水分測定法(第二法烘干法)，取雞胚藥材粉末(過二號篩)2 g，均勻平鋪于干燥恒質量的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，開啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h，蓋好蓋移置干燥器中，放冷30 min，稱質量，再在上述溫度干燥1 h，然后放冷并稱定質量，連續兩次干燥的差異值應小于5 mg，如未達到要求，繼續上述干燥、冷卻和稱質量步驟，直至連續兩次干燥的差異值小于5 mg，根據減少的質量，計算雞胚藥材中的含水量(%)。

1.2.5總灰分測定 參照《中國藥典》2015年版四部[11]通則2302灰分測定法，取雞胚藥材粉末2 g，置熾灼至恒質量的坩堝中，然后稱定質量(準確0.01 g)，于加熱板或電爐上緩緩碳化，注意避免燃燒，使粉末完全炭化，然后將坩堝和碳化好的樣品移至馬弗爐中，逐漸升高溫度至550 ℃，使其完全灰化并恒重，然后根據殘渣質量計算供試品中總灰分的含量(%)。

1.2.6揮發性鹽基氮測定 試驗采用“中華人民共和國國家標準GB 5009.228-2016食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定 第三法(微量擴散法)”進行。稱取雞胚藥材粉末10 g，置于具塞錐形瓶中，加水100 mL，邊加邊振搖，使試樣勻分散于液體中，浸漬30 min，過濾，取濾液即得供試品溶液。然后將水溶性膠(阿拉伯樹膠10 g、水10 mL、甘油50 mL及碳酸鉀5 g，研勻)均勻涂布于擴散皿的邊緣，在擴散皿中央內室加入2%硼酸水溶液1 mL，并滴加1滴混合指示劑(甲基紅乙醇溶液 ∶溴甲酚綠乙醇溶液 = 1 ∶5)溶液；在擴散皿外室精密加入供試品溶液1 mL，蓋上磨砂玻璃蓋，然后迅速加入飽和碳酸鉀溶液1 mL，并立刻蓋密，于實驗臺上輕輕轉動，使溶液充分混勻；置于(37±1)℃溫箱內2 h后，取出，放至室溫，用0.01 mol/L鹽酸滴定液滴定至混合指示液終點顏色變為紫紅色，記錄消耗的鹽酸體積，同時做試劑空白。按上述同法平行測定2次，計算平均值。鹽基氮含量計算公式：X={[(V1-V2) ×c×14]/[m×(V/V0) ×100}。X為試樣中揮發性鹽基氮的含量(mg/100 g或g/L)，V1為試液消耗鹽酸或硫酸標準滴定溶液的體積(mL)，V2為試劑空白消耗鹽酸或硫酸標準滴定溶液的體積(mL)，c為鹽酸或硫酸標準滴定溶液的濃度(mol/L)，14為滴定1.0 mL鹽酸[c(HCl)=1.000 mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]標準滴定溶液相當的氮的質量(g/mol)，m為試樣質量(g)，或試樣體積(mL)，V為準確吸取的濾液體積(mL)。本方法中V=1，V0為樣液總體積(mL)；本方法中V0=100。

1.2.7醇溶性浸出物測定 按《中國藥典》2015年版四部[11]通則2201浸出物測定法中醇溶性浸出物測定法，取雞胚藥材粉末(過二號篩)2 g，置100 mL的錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，密塞，并稱定質量，室溫靜置1 h后，水浴回流1 h；放冷，稱定質量，用乙醇補足減失質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液25 mL置蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，然后置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2 結果

2.1 性狀鑒別

雞胚藥材呈規則塊狀，長3.3～8.5 cm，寬2.0～6.0 cm。表面棕黃色至黑棕色，被深黃色至暗棕色的柔軟羽毛，排列稀疏至致密。質地硬脆、易折斷，斷面不平坦。夾雜黃色不規則大小不等的塊狀物，呈脂肪樣光澤，摸之有滑膩感，氣腥，味微咸。見圖2。

注：A批號為20160929，B批號為20161124，C批號為20170302。

2.2 顯微鑒別

雞胚粉末呈黃色至棕黃色。根據3批樣品粉末顯微特征表現為：羽毛雜色，多呈灰色；羽桿呈竹節狀，每節長30～175 μm；羽根中間有空隙，細胞呈長方形排列，長34～87 μm；肌纖維組織排列成片狀，纖維多平直或呈微波狀，直徑1.7～5.5 μm；骨碎片組織呈不規則碎塊狀，表面有細小裂縫狀或圓形空隙，可見小孔狀骨陷窩。見圖3。

肌纖維組織 骨碎片組織 羽毛

2.3 薄層色譜鑒別

通過對樣品提取方法和色譜條件的優化，通過耐用性實驗的考察，得到 “1.2.3”項下的最佳條件，按上述薄層色譜鑒別方法，對3批樣品進行測定，結果顯示特征條帶清晰，分離度良好，供試品色譜中與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的條帶，見圖4。

注：1為20160929，2為20161124，3為20170302，4為對照藥材。

2.4 水分、總灰分、揮發性鹽基氮和醇溶性浸出物測定

3批雞胚藥材的水分、總灰分、揮發性鹽基氮和醇溶性浸出物結果見表1，結果顯示不同批次的雞胚中水分、總灰分、揮發性鹽基氮含量和醇溶性浸出物含量存在一定差異，推測可能與母體的生存環境、飲食以及藥材的取樣時間有關。

表1 雞胚的水分、總灰分、揮發性鹽基氮和醇溶性浸出物測定結果

3 討論

雞胚作為黔南地區具有典型民族特色的藥材之一，尤其在治療骨傷方面發揮著重要的作用，具有良好的開發和應用前景。但是目前關于雞胚質量控制的相關報道較少，為進一步促進雞胚藥材的應用，建立其質量控制標準具有十分重要的意義。

性狀鑒定作為一種傳統的鑒定手段，經過我國中醫工作者長期積累的經驗總結，具有簡單、直觀、快速的優點[12-14]，于是本研究首先對雞胚藥材的性狀特征進行了描述。中藥顯微鑒定是中藥材鑒別的主要方法之一，主要利用顯微技術確定中藥品種和質量[15-19]，具有快速、專屬性強和成本低等特點，因此本研究通過粉末制片觀察到明顯的特征，如灰色的羽毛、竹節狀的羽桿、中空的羽根、片狀的肌纖維組織、表面有空隙及陷窩的不規則骨碎片組織等，這些都可作為雞胚鑒定的依據。

薄層色譜鑒別中，本研究通過考察不同提取溶劑(三氯甲烷、70%乙醇、95 %乙醇、甲醇、95%乙醇)，不同顯色與檢視方法，結果表明70%乙醇為提取溶液，點樣、展開后，茚三酮試劑顯色后信息豐富，故選擇70%乙醇為提取溶劑，茚三酮試劑加熱顯色后日光下觀察作為檢視方法。雞胚屬于動物藥類，其含有豐富的氨基酸類成分，因此采用正丁醇-冰醋酸-水系統作為展開劑，為了能使樣品中的斑點具有良好的分離度，考察了不同比例的正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶2 ∶2、8 ∶3 ∶3、8 ∶2 ∶3、8 ∶3 ∶2)對樣品的展開效果，結果顯示，展開劑為正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水為8 ∶3 ∶2時，顯色后信息豐富，條帶Rf值適中，故選擇此比例為展開劑。不同來源的薄層板于不同溫、濕度下的色譜圖條帶均清晰，表明該方法適用性好，不同廠家來源的硅膠G板均能較好的鑒別雞胚藥材，同時相對濕度和溫度對該方法的影響不明顯。同一批雞胚藥材供試品溶液制備后，于室溫放置3 d后的色譜圖前后無明顯差異，說明該樣品穩定性良好。于是采用上述建立的薄層色譜法對3批雞胚藥材進行鑒定，結果顯示各批次藥材主條帶明顯、清晰、分離度良好，同時與對照藥材主條帶顏色和位置保持一致，進一步說明該方法專屬性好，可用于不同批次雞胚藥材的有效鑒別；然而不同產地雞胚藥材中主條帶顏色深淺存在差異，提示不同批次雞胚藥材中該類成分含量可能不同，這可能與受精卵的來源及其具體孵化時間有關，具體原因還有待進一步研究。

雞胚藥材通常置通風干燥、防霉、防蛀的條件下，考慮到雞胚藥材貯藏期間易霉變和蟲蛀，因此，制定水分測量，最終暫定水分不得過10.0%。總灰分作為評定藥材純度的重要指標，本研究暫定總灰分不超過9.0%。雞胚富含蛋白質，動物蛋白由于細菌及酶的作用使之腐敗分解而產生的游離氨和揮發性羥胺、芳香胺類，如三甲胺、尸胺、酪胺、色胺、吲哚等揮發性堿性物質，為確保臨床用藥安全，對揮發性堿性物質的檢查是控制其質量的一項重要內容[20-23]。本研究結果顯示，雞胚中揮發性鹽基氮的含量0.25 mg/100 g遠小于“GB2707-2016 國家食品安全標準鮮(凍)畜、禽產品”中規定的15 mg/100 g限度以及“DBS 32/007-2016 江蘇省食品安全地方標準 熟制雞胚蛋(活珠子)”中規定的10 mg/100 g，故本品質量標準中暫不考慮列入揮發性鹽基氮的檢查。由于雞胚在民間常用乙醇加工處理后用藥，因此選擇研究醇溶性浸出物。根據結果暫定本品醇溶性浸出物不得少于15.0%。

綜上所述，本研究中雞胚粉末的顯微鑒別和薄層色譜鑒別方法可作為快速鑒別正品雞胚藥材提供依據，同時水分、總灰分檢查和醇溶性浸出物測定為控制雞胚藥材的質量提供了參考。