2015—2019年貴州省某三甲醫院分離細菌的分布及對常用抗菌藥物的耐藥率變化*

張露丹， 周丹， 劉寶， 曹慧軍， 費櫻,***

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004)

自1928年世界上第1種抗生素—青霉素被發現以來，抗菌藥物與病原微生物之間的抗爭從未停止[1]。雖然針對耐藥菌的新藥研發取得了較大的進展，但細菌通過產生藥物滅活酶、鈍化酶、藥物作用靶位結構改變等耐藥機制產生了各種多重耐藥[2-3]。全國耐藥監測網收集國內13所二級和36所三級醫院臨床分離菌藥敏試驗結果進行分析，由于不同地區不同醫院抗菌藥物使用不同，不同醫院分離的主要細菌也不盡相同，細菌耐藥性也存在很大差異[4-5]。貴州某三甲醫院是集醫療、教學、科研及健康管理為一體的大型綜合性醫院，其細菌耐藥形勢有其自身的特點，動態監測細菌耐藥性的變遷，防止耐藥菌株的流行十分必要。因此，本研究選取該院2015—2019年細菌耐藥監測數據，對檢出的細菌分布和藥敏結果進行分析，為醫院管理部門制定相關控制措施和臨床醫生合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2015年1月1日—2019年12月31日醫院不同標本分離的所有需氧菌(真菌、分枝桿菌除外)32 277株，標本來源包括呼吸道(n=14 462)、尿液(n=5 281)、傷口膿液(n=4 475)、血(n=3 540)、漿膜腔積液(n=1 438)、腦脊液(n=207)、生殖道(n=848)及其他(包括關節液、膽汁、胃液、活組織及乳汁等，n=2 026)。見表1。

1.1.2主要試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂、嗜血桿菌巧克力瓊脂、Muller Hinton瓊脂、含血Muller Hinton瓊脂、頭孢硝噻吩紙片(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，藥敏紙片(英國OXOID公司)，多黏菌素B E-test檢測條(溫州市康泰生物科技有限公司)，MicroScan WalkAway SI 96 plus全自動細菌鑒定與藥敏分析儀、Pos Combo Panel Type 33和Neg Urine Combo Panel Type 61藥敏卡(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗 采用全自動細菌鑒定與藥敏分析儀進行細菌鑒定及藥敏試驗，細菌鑒定采用8進制計算法將28個生化反應轉換成8位生物數碼，計算機系統自動將這些生物數碼與編碼數據庫進行比對獲得相似系統鑒定值及菌種鑒定，部分苛養菌采用手工生化管輔助鑒定[6]；藥敏試驗采用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法、紙片擴散 (kindy-bauer, KB)法和E-test法，藥敏結果判讀參照臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI；2018版)M100-S28標準[7]，對替加環素的藥敏判斷標準≤2 mg/L為敏感，≥8 mg/L 耐藥[8]。

1.2.2質控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、流感嗜血桿菌ATCC49247、肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.3 統計學分析

應用Whonet 5.6軟件對細菌檢出率和耐藥率數據進行統計，使用SPSS 26軟件進行統計學分析，定性資料采用頻數(%)表示，檢出率或耐藥率的比較及年度線性變化趨勢采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床分離細菌

共分離32 277株細菌，其中革蘭陽性菌9 080株(占28.1%)，革蘭陰性菌23 197 株(占71.9%)。革蘭陰性菌居前5位的分別是大腸埃希菌(6 047株，18.7%)、克雷伯菌屬(5 114 株，15.8%)、不動桿菌屬(3 410株，10.6%)、銅綠假單胞菌(2 037株，6.3%)及腸桿菌屬(1 793株，5.6%)，革蘭陽性菌居前5位的分別是凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococcus，CNS，3 558株，11.0%)、金黃色葡萄球菌(2 425株，7.5%)、腸球菌屬(2 405株，7.5%)、肺炎鏈球菌(251株，0.8%)及無乳鏈球菌(109株，0.3%)。見表1。

表1 2015—2019年貴州省某三甲醫院臨床標本分離細菌[n(%)]

2.2 分離細菌的標本來源

分離自臨床的32 277株細菌，主要來源于呼吸道和尿液標本，分別占44.8%、16.4%，其次傷口膿液和血液標本占比也較高，分別占13.9%、11%，漿膜腔積液標本占4.4%，生殖道標本占2.6%，腦脊液標本占0.6%，其他標本占6.3%。

2.3 不同標本來源分離的細菌

呼吸道標本主要分離細菌為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌，泌尿道標本主要分離細菌為大腸埃希菌、屎腸球菌和肺炎克雷伯菌，傷口膿液標本主要分離細菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，血標本主要分離細菌為CNS、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌。見表2。

表2 2015—2019年貴州省某三甲醫院不同來源標本居前5位的細菌種類

2.4 革蘭陽性菌藥敏結果

2.4.1葡萄球菌屬 2015—2019年 5年間金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林CNS(methicillin-resistant CNS，MRCNS)對利福平耐藥率均呈下降趨勢(P<0.032)，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveS.aureus，MSSA)對克林霉素耐藥率也有下降趨勢(P<0.001)；未檢出對萬古霉素耐藥金黃色球菌，極少數MSSA對利奈唑胺耐藥；未檢出對萬古霉素和利奈唑胺耐藥的MRCNS，極少數MRCNS對萬古霉素和利奈唑胺耐藥，葡萄球菌屬對奎奴普丁或達福普汀耐藥率<2.7%；甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(meticillin-resistantS.aureus，MRSA)和MRCNS對青霉素G、慶大霉素、利福平、氟喹諾酮類抗生素、復方新諾明、克林霉素、紅霉素、奎奴普丁或達福普汀及四環素的耐藥率明顯>MSSA和MSCNS(P<0.002)。見表3和表4。

表3 2015—2019年貴州省某三甲醫院金黃色葡萄球菌對常見抗菌藥物的耐藥率

表4 2015—2019年貴州省某三甲醫院CNS對常見抗菌藥物的耐藥性

2.4.2腸球菌屬 2015—2019年糞腸球菌對所監測抗菌藥物的耐藥率無明顯變化，糞腸球菌對利奈唑胺、萬古霉素耐藥率分別<2.1%和0.7%；屎腸球菌對高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素、利福平、環丙沙星、呋喃妥因的耐藥率有下降趨勢(P<0.03)；未檢出對利奈唑胺耐藥的屎腸球菌，對萬古霉素耐藥率小于0.4%，屎腸球菌對奎奴普丁/達福普汀耐藥率為10.8%。屎腸球菌對青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素、利福平、氟喹諾酮類抗菌藥物、紅霉素、呋喃妥因的耐藥率>糞腸球菌(P<0.001)，糞腸球菌對四環素的耐藥率高于屎腸球菌(P<0.001)。見表5。

表5 2015—2019年貴州省某三甲醫院糞腸球菌和屎腸球菌對常見抗菌藥物的耐藥率

2.4.3鏈球菌屬 β溶血性鏈球菌對青霉素耐藥率較低(<2%)，對頭孢曲松、頭孢噻肟、利奈唑胺、萬古霉素保持高度敏感耐藥率均為0%，對紅霉素、克林霉素的耐藥率較高(>60%)。肺炎鏈球菌主要分離自非腦脊液標本，對紅霉素、克林霉素耐藥率>90%，對阿莫西林、左氧氟沙星相對敏感，耐藥率<6.4%，未檢測出耐利奈唑胺和萬古霉素的鏈球菌屬細菌。

2.5 革蘭陰性菌藥敏結果

2.5.1腸桿菌科細菌 2015—2019年大腸埃希菌對青霉素類、頭孢菌素類(除頭孢他啶)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、四環素耐藥率均>60%，對氨曲南、氟喹諾酮類藥物耐藥率在50%左右，對氨基糖苷類抗生素耐藥率也在40%左右，均高于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，但對頭孢菌素類、氨曲南、氨基糖苷類、四環素有下降趨勢(P<0.04)；對β-內酰胺類-酶抑制劑合劑(除氨芐西林/舒巴坦)耐藥率<10%，低于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，對碳青霉烯類、阿米卡星的耐藥率較低(<2.4%)，未檢出對替加環素耐藥的大腸埃希菌；2015—2019年肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類(除頭孢他啶)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑耐藥率大于40%，對β-內酰胺類-酶抑制劑合劑(除氨芐西林/舒巴坦)、氟喹諾酮類抗生素耐藥率為20%左右，5年間有增長趨勢(P<0.005)；對碳青霉烯類、阿米卡星的耐藥率在10%左右，>大腸埃希菌(P<0.001)，且5年間有增長趨勢(P<0.001)；對替加環素耐藥率為0.3%，5年間有下降趨勢。見表6。

表6 2015—2019年貴州省某三甲醫院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對常見抗菌藥物的耐藥率

2.5.2非發酵革蘭陰性菌 2015—2019年銅綠假單胞菌對頭孢菌素類(除頭孢他啶)、哌拉西林/他唑巴坦、碳青霉烯類、氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、氟喹諾酮類耐藥率在10%～25%之間，且對后4種抗生素5年間耐藥率有下降趨勢(P<0.03)，對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星耐藥率較低，分別為10%和5%左右，但五年間對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率有升高趨勢(P=0.048)。2015—2019年鮑曼不動桿菌對頭孢菌素類、氨曲南、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素及甲氧芐啶-磺胺甲噁唑耐藥率菌均>65%，>銅綠假單胞菌(P<0.001)，且5年間有增長趨勢，差異有統計學意義(P<0.014)，未檢出對替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌。見表7。

表7 2015—2019年貴州省某三甲醫院銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對常見抗菌藥物的耐藥率

2.5.3其他革蘭陰性桿菌 流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率>55%，對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦高度敏感，但3種抗生素均已經出現非敏感菌株，不敏感率2.7%～4.8%；環丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南均出現較高的不敏感率，不敏感率15.6%～34%。

2.6 多重耐藥菌檢出情況

多重耐藥菌檢出結果顯示，2015—2019年MRSA、MRCNS、耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)、耐碳青霉烯大腸埃希菌(carbapenem-resistantE.coli，CRECO)和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosa，CRPA)的檢出率無明顯的增減趨勢，其5年平均檢出率分別為29.1%、84.1%、0.2%、1.0%及28.0%；而5年間耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，CRKP)和耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)的檢出率逐年明顯上升(P<0.001，表8)。重癥監護病房(intensive care unit，ICU)居監測七種多重耐藥菌檢出科室的首位，神經內科和神經外科為CRKP、CRPA及CRAB檢出科室的第2位或第3位。見表9。

表8 2015—2019年貴州省某三甲醫院多重耐藥菌檢出率

表9 貴州省2015—2019年某三甲醫院不同多重耐藥菌居前5位的科室

3 討論

本研究中5年間臨床分離細菌的菌株總數、革蘭陽性或陰性菌比例和分離居前5位細菌與2019年中國細菌耐藥監測網(China antimicrobial surveillance network, CHINET)三級醫院細菌耐藥監測和中南大學附屬醫院細菌耐藥監測數據基本一致[4，9]。臨床分離菌株標本來源第1位為呼吸道標本(44.8%)高于中南大學附屬醫院(39.3%)和武漢同濟醫院(34.6%)，而血液標本位于尿液、傷口膿液標本之后居第4位[9-10]。雖然臨床微生物實驗室通過向臨床科室宣教鼓勵送檢更有意義的血液等無菌體液標本，但送檢率仍處于較低水平。血液標本分離株中CNS占36.9%，略高于全國平均水平[11]。有報道指出CNS血培養陽性僅12%～26%被診斷為血流感染[12]，CNS作為條件致病菌，由于免疫抑制劑、化療藥物的應用以及侵襲性的診療操作，使其在醫院感染病原菌中所占比例越來越高。采血過程中未嚴格無菌操作也會引起污染，因此需多次送檢血培養，同時結合病史、其它實驗室檢查(白細胞計數、C-反應蛋白、降鈣素等)、血培養陽性套數及血培養報陽時間等因素綜合分析。

2015—2019年5年間金黃色葡萄球菌對利福平耐藥率逐年下降，利福平耐藥與rpoB基因突變密切相關，而且在rpoB基因突變的過程中利福平是主要的選擇性壓力[13]，故本研究中利福平耐藥率逐年下降可能與環境中的利福平暴露減少相關。VRE在不同國家地區的檢出率不同，與其他國家和地區相比，國內VRE檢出率仍較低[14-15]。VRE通常都以萬古霉素耐藥屎腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcusfaecium，VREfm)為主，本研究中VREfm維持在較低水平且無明顯變化趨勢，與2008—2017年CHINET腸球菌屬耐藥性監測報告VREfm檢出率1.2%大致相同[16]。腸球菌球菌中最常檢出的耐萬古霉素基因是vanA和vanB[17]，國內外分子流行病學研究發現大多數引起人類感染的VRE是 CC17 克隆群屎腸球菌，除對萬古霉素耐藥外，還對氨芐西林、高濃度氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥，而且這些菌株通常攜帶有esp毒力基因[18]。

本研究中大腸埃希菌對青霉素類、頭孢菌素類(除頭孢他啶)、氨曲南的耐藥率>50%，且均>其他腸桿菌科細菌，提示其產ESBLs或AmpC的比例高于其他腸桿菌科細菌[10]。歐洲的耐藥菌感染所致死亡率調查研究結果發現，第3代頭孢菌素耐藥大腸埃希菌是引起感染死亡最多的病原菌[19]，故微生物實驗室中對于產ESBLs或AmpC大腸埃希菌的及時檢出對于指導臨床針對性用藥，從而降低病死率十分重要。碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRE)的流行播散造成了醫療保障體系沉重的負擔。由于碳青霉烯類耐藥菌株往往對其他臨床常用抗菌藥物也耐藥，使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境，進而導致其所致感染的高病死率[20]。根據全國耐藥監測數據CRE中CRKP占到72.4%[4]，本院5年間CRKP檢出率明顯增加，增長趨勢與國內相關報道[21]一致，主要來于ICU、神經外科、神經內科，這些病區的病人大多為免疫力低下的老年人或處于無意識狀態，而且使用侵入性醫療設備[22]。據文獻報道，神經外科11例CRKP感染患者中7例證實為醫院感染，患者環境物體表面和部分醫務人員手、咽拭子檢出CRKP[23]。因此，CRKP存在醫院染暴發可能，通過CRKP感染患者的病原體污染環境和醫務人員的手導致感染的傳播。文獻報道，住院患者抗菌藥物的使用，尤其是廣譜頭孢菌素的使用與肺炎克雷伯菌的耐藥存在相關性，ICU病房中CRKP的檢出碳青霉烯類抗生素的使用是獨立的危險因素[24]。

鮑曼不動桿菌是引起醫院感染的常見致病菌[6]，近年來鮑曼不動桿菌呈上升趨勢已成為非發酵菌的感染中第一位的細菌[9-10]。本院鮑曼不動桿菌對3、4代頭孢菌素類、亞胺培南耐藥率逐年上升，多重耐藥不動桿菌常存在染色體編碼的β-內酰胺酶，包括C類頭孢菌素酶、D類苯唑西林酶及質粒介導的A類β-內酰胺酶[25]。2015—2019年5年間鮑曼不動桿菌氨基糖苷類抗生素的耐藥率也逐年上升，16SrRNA甲基化酶是介導高水平氨基糖苷類抗生素耐藥的機制，armA和rmtB是主要基因[26]，奚俊等[27]報道armA在鮑曼不動桿菌廣泛存在。銅綠假單胞菌除了天然耐藥外，對其他類抗菌藥物的耐藥率均在30%左右及以下，需要對銅綠假單胞菌的耐藥性持續關注。

在應對多重耐藥菌的威脅時，只有堅持以預防感染為中心，抗菌藥物管理和醫院感染管理兩手抓兩手硬[28]。細菌耐藥監測工作必要堅持不懈，并加提高數據分析的能力，以及時反映醫院和地區的耐藥菌流行情況和變化趨勢，為醫院管理者制定感染控制政策提供參考，為醫生經驗性使用抗菌藥物提供依據。