沉默信息調節因子1基因敲除小鼠椎間盤軟骨組織中膠原的動態變化*

夏曉楓， 車彪， 覃松， 劉駿， 羅斌

(長江航運總醫院 骨外科， 湖北 武漢 430014)

椎間盤退行性疾病是臨床骨科常見疾病，多表現為脊柱贅生物形成、椎間隙狹窄、椎間盤突出等臨床特征。盡管牽引療法、開放性手術、消融術等都可給椎間盤退行性疾病患者帶來一定的臨床收益[1-3]，但目前尚未有任何方法能夠完全逆轉椎間盤退變趨勢。椎間盤退行性疾病是在多種因子作用下導致椎間盤脊髓細胞各膠原水平及數量變化所產生的結果，探討影響膠原動態變化的相關因子對于幫助臨床醫師認識椎間盤退行性疾病具有重要的臨床意義[4]。國內外研究指出，沉默信息調節因子1(silent information regulator1，SIRT1)可影響細胞衰老進程[5-6]，楊宜锜等[7]的研究則明確指出SIRT1可對骨代謝進行調節，盡管SIRT1基因表達水平與椎間盤退行性疾病或椎間盤退變相關細胞間存在一定的關系，但目前對于SIRT1基因如何影響椎間盤退行性病變的作用機制尚未完全清楚。Ⅰ型膠原(type-Ⅰ collagen，ColⅡ)、Ⅱ型膠原(type-Ⅱ collagen，ColⅡ)和Ⅹ型膠原(type-X collagen，Col X)水平的改變與骨細胞凋亡和衰老密切相關，而SIRT1可能通過影響膠原水平從而作用于椎間盤退行性改變[7]。為進一步分析SIRT1在椎間盤中的作用，本研究以Col2-CreSIRT1co/co(SIRT1+/+)小鼠作為動物模型，觀察敲除SIRT1后小鼠軟骨組織中ColⅡ、ColⅡ及ColX等膠原的動態變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SIRT1co/co小鼠(白色，雄性)和Col2-CreERT2小鼠(黑色，雌性)均購自于美國杰克遜實驗室。

1.1.2主要試劑及儀器 他莫昔芬(北京凱瑞基生物科技有限公司)，戊巴比妥鈉(棗莊水泰嵐化工有限公司)，甲醛溶液(廈門慧嘉生物科技有限公司)，蘇木精-伊紅(上海藍季科技發展有限公司)，胰酶(北京凱瑞基生物科技有限公司)，考馬斯亮藍(上海金穗生物科技有限公司)，SIRT1引物[生工生物工程(上海)有限公司]，山羊抗兔ColⅡ、ColⅡ及ColX一抗(均購自上海江萊生物科技有限公司)，核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher，上海艾研生物科技有限公司)、3.0T核磁共振(Achieva，飛利浦)、數字化X光機(島津，日本)。

1.2 方法

1.2.1分組 所有小鼠均飼養于二級動物房內，12 h明暗循環(明7 ∶00～19 ∶00，暗19 ∶00～次日7 ∶00)，清潔飲水、自由飲食。取出生6周的Col2-CreERT2小鼠與SIRT1co/co小鼠交配，挑選基因型為Col2-CreSIRT1co/co(SIRT1+/+)的小鼠為研究對象，取6周齡小鼠15只，Col2-CreSIRT1co/co小鼠腹腔注射10 g/L的他莫昔芬(75 mg/kg給藥)誘導小鼠組織中的SIRT1基因敲除獲得SIRT1-/-小鼠作為試驗組；另取30只SIRT1+/+小鼠隨機分為正常組及模型組，每組15只，均腹腔注射等體積的生理鹽水(1次/d、連續5 d)。

1.2.2造模及樣本收集 取模型組、試驗組小鼠，俯臥位并固定四肢，頸后部剃毛備皮準備，消毒鋪巾后肌注2%戊巴比妥鈉(以40 mg/kg給藥)麻醉小鼠，沿腰背部棘突上正中切口，并沿骨膜剝離、去除L1～L6椎間棘突、關節突、棘間韌帶、棘上韌帶等，兩側豎棘肌切斷后檢查是否切除干凈，檢查完全后逐層縫合筋膜、皮膚，術后肌注50 000 U青霉素抗感染，連續3 d；正常組行假手術，采用試驗組同樣的方法麻醉、消毒，但僅做切口后縫合，術后也給予抗感染處理。所有小鼠行手術后均單獨放置于飼養箱中飼養，正常給食、喂水，同等溫濕度下喂養。術后第4、8及12周時，每組隨機選取5只小鼠，均腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉后處死，完整取下上下軟骨板與椎體交界處的L5～L6椎間盤，用于后續實驗。

1.2.3X線片及組織學檢查 3組小鼠于手術第4周時行X線片檢查并記錄結果，并將1.2.2項下得到的椎間盤組織于10%甲醛溶液中固定、固定完全后流動水沖洗，并梯度乙醇脫水，浸蠟包埋并做石蠟切片，HE染色，正置生物顯微鏡下觀察。

1.2.4軟骨組織中SIRT1表達 取術后第4周獲得的椎間盤軟骨組織樣本，剪碎組織小塊后胰酶消化，過濾、離心后取上清液，采用考馬斯亮藍染色法、核酸蛋白測定儀測定蛋白濃度，制膠、電泳、半干法轉膜、加一抗、二抗孵育后，化學發光底物反應，以β-actin為內對照；另取上清液做實時PCR擴增定量分析，SIRT1引物上游序列5′-CAGTGTCATGGTTCCTTGC-3′、下游序列5′-CACCGAGGA ACTACCTGAT-3′，產物長度104 bp，提取細胞總RNA，逆轉錄后PCR擴增，共40個循環，以U6為內參。

1.2.5ColⅠ、ColⅡ及Col X表達 取術后第4、8及12周小鼠的軟骨組織切片，甲醇溶液孵育15 min，胰酶消化10 min、5%BSA封閉，加兔多克隆抗體ColⅠ、ColⅡ及Col X一抗，4℃過夜，加山羊抗兔IgG二抗(37 ℃、15 min)，加抗生蛋白鏈菌素-HRP孵育(37 ℃、10 min)，DAB顯色、蘇木精染色，脫水、封固，陰性對照組一抗以PBS代替。每個樣本取3個視野行統計分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 組織學改變、X線觀察及SIRT1水平

術后第4周的HE染色及X線片檢查結果顯示，正常組小鼠椎間盤纖維結構清晰、層次分明，且呈同心圓的規整性排列、髓核內可見髓核脊索細胞；模型組小鼠纖維環排列欠完整，可見輕度增生的軟骨細胞、膠原環出現排列紊亂、髓核細胞數目有所減少；試驗組小鼠椎間盤纖維環明顯紊亂，髓核細胞明顯減少；X線片結果顯示，正常組和試驗組小鼠頸椎和腰椎段生理前凸角度均較模型組大。Western Blot法檢測SIRT1圖像軟件灰度值分析結果及實時定量PCR結果顯示，試驗組小鼠軟骨組織的SIRT1水平顯著低于正常組和模型組(P<0.05)，模型組SIRT1水平顯著低于正常組(P<0.05)。詳見圖1～圖4。

注：A為正常組，B為模型組，C為試驗組。

注：A為正常組正位圖，B為正常組側位圖，C為模型組正位圖，D為模型組側位圖，E為試驗組正位圖，F為試驗組側位圖。

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.2 ColⅠ、ColⅡ及Col X表達

結果顯示，術后第8及12周時的3組小鼠椎間盤軟骨組織中Col Ⅰ、Col X水平高于術后第4周、Col Ⅱ低于術后第4周，差異有統計學意義(P<0.05)；同時點比較，正常組各時點的Col Ⅰ、Col X均低于模型組和試驗組，差異有統計學意義(P<0.05)，試驗組ColⅠ、ColX高于模型組， ColⅡ顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖5。

注:(1)示同時點與正常組比較，P<0.05；(2)示同時點與模型組比較，P<0.05；(3)示同組間與術后4周比較，P<0.05；(4)示與術后8周比較，P<0.05。

表1 各組小鼠不同時點椎間盤軟骨組織的ColⅠ、ColⅡ及Col X表達

3 討論

當前尚未明晰椎間盤退變的具體發生機制，且也尚未有任何方法能夠完全逆轉椎間盤退變趨勢，導致椎間盤退行性疾病治療效果十分有限。從多方面探究椎間盤退變機制也是當前學者們研究的重點。椎間盤由富有彈性的膠狀物組成的中央部髓核和中位呈同心圓排列的纖維環組成，是人體中最大的無血管組織。正常情況下的髓核細胞處于生理性低氧張力、酸性環境中，其營養供給來源于纖維環途徑和軟骨終板途徑[8-10]，且以后者為椎間盤最為重要的供給途徑。但當軟骨終板細胞發生退變時，軟骨終板鈣化，降低椎間盤組織物質代謝，導致細胞外基質聚集、水分減少、乳酸堆積并導致椎間盤細胞死亡[11-12]；軟骨終板細胞退變也可通過影響腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等炎性因子的水平而促進椎間盤退變[13]：這些改變都能夠從膠原成分的動態改變加以分析。

ColⅠ是同心圓組織成分，負責椎間盤的抗力張強度(即吸收傳遞、牽拉變形等能力)，ColⅡ是反應軟骨基質的承受應力(即吸收震蕩、彈性形變的能力)，ColX則為軟骨板提供了鈣化環境，ColⅠ升高、ColⅡ下降導致髓核應力平衡被打破從而影響椎間盤的穩定性[14-15]，且ColⅡ、ColX與基質血管之間又可通過激活Ca+通道而促進骨化[16-17]?？梢哉f，ColⅠ、ColⅡ、ColX的動態變化可有效反應椎間盤退行性程度。本研究選擇的 Col2-CreSIRT1co/co小鼠是一類含雌激素受體的配體結合區突變體(ERT)與Cre重組酶融合蛋白表達的小鼠，注射他莫昔芬后，其代謝產物與ERT相結合激活酶活性，從而達到SIRT1基因敲除的目的。目前，手術是建立椎間盤退變小鼠最常用的手段，與假手術的正常組比較，模型組小鼠膠原術后各時點的ColⅠ、ColX、ColⅡ均顯著變化，這提示模型組發生了椎間盤退行性改變；而試驗組與模型組相比，術后各時點的ColⅠ、ColX、ColⅡ均顯著變化，意味著試驗組不僅出現了椎間盤退行性改變，且這種病變進程相較于模型組加快，同既往研究類似[7,14]。就正常組、模型組、試驗組3組小鼠的Western blot法檢查SIRT1的灰度值比較，試驗組的SIRT1表達下降，這提示，SIRT1參與了小鼠椎間盤退行性病變過程，且可能是SIRT1基因通過影響ColⅠ、ColX、ColⅡ的表達從而參與椎間盤退變。

髓核細胞數量減少是椎間盤退變最主要的病理表現之一，而細胞凋亡、老化都可導致髓核細胞活性喪失[18]。SIRT1是沉默信號調控因子(silence signal regulating factor 2，Sirt2)最為相似的同系物，能夠延緩多種細胞的衰老、凋亡，可作用于核細胞κB(nuclearfactor-κ B，NF-κB)、P53、FOXO發揮生物學功能[19-21]。SIRT1可對P53去乙?；种破浠钚远鴾p少P53所調控的細胞凋亡信號通路；SIRT1對NF-κB的影響機制較復雜[22-24]，目前認為SIRT1可對細胞凋亡蛋白1抑制子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)的啟動子相結合而導致NF-κB信號通路未能激活；SIRT1還通過去乙?；苯?間接調控叉頭框轉錄因子(forkhead box，FOXO)活性而抑制細胞Fas(細胞凋亡基因)配體活性，以及通過FOXO延長細胞損傷DNA的自我修復時間從而提高其抗應激能力[25]：SIRT1可能正是通過影響NF-κB、P53、FOXO一種或多種途徑調控髓核細胞衰老、凋亡。因此，在SIRT1基因被敲除后，調控髓核細胞衰老、凋亡能力減弱，從而導致病變進程加快，而相比于模型組，其膠原成分變化更為明顯。

綜上所述，本研究發現，敲除椎間盤模型小鼠的SIRT1基因會使小鼠軟骨組織中的ColⅠ、ColX水平升高和ColⅡ水平降低。但未就SIRT1基因影響的具體信號通路加以分析，未就SIRT1基因對椎間盤小細胞增殖、凋亡進行研究；且在椎間盤中其炎癥反應的劇烈程度也是導致退行性變化的重要因素之一，未就SIRT1基因是否對于TNF-α、IL-10等重要炎癥因子有相同的作用趨勢加以研究，這些都有待于后續研究。