人工濕地植物根際降解β-HCH細菌篩選及鑒定

羅 爽,梁延鵬,3,曾鴻鵠,3,覃禮堂,4

(1.桂林理工大學 環境科學與工程學院，廣西 桂林541004；2.廣西巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，廣西 桂林541004；3.廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，廣西 桂林541004；4.廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室科教結合科技創新基地，廣西 桂林541004)

0 引言

工業純六氯環乙烷(hexachlorocyclohexane，HCHs)由苯在紫外光作用下光化學氯化制成，主要由4種同分異構體α-HCH、β-HCH、γ-HCH和δ-HCH組成，其中β-HCH性質最為穩定，極難降解[1]。人工濕地能有效控制農業面源污染，且比常規污水處理廠更靈活簡便，投資少[2]。微生物是人工濕地的重要組成部分，研究表明：微生物可將農藥通過酶促反應降解，將農藥降解為CO2、H2O和N2等無毒物質[3]，如土壤中雙對氯苯基三氯乙烷(dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)等難降解有機氯農藥，通過投加外源降解菌以及降解菌提取物，能顯著提高系統中DDT等有機氯農藥的去除效率[4-8]。迄今，國內外微生物用于降解HCHs的研究中，大多數是放線菌中鏈霉菌的降解效果較好[9-13]。也有學者報道鞘脂鞘氨醇單孢菌(Sphingobiumpaucimobilis)對HCHs的4種異構體均能起到降解作用，鞘脂醇單胞菌B90A(SphingobiumindicumB90A)與β-HCH于30 ℃下反應72 h，對β-HCH的降解率為86%[14]。其他農藥方面，比如秦晶篩選的硫丹耐受菌，在外加碳源情況下，對硫丹的最高降解率僅為31.02%[15]。目前，微生物去除農藥的研究主要應用于特定條件下的微生物培養分離技術，對利用人工濕地優勢微生物去除農藥的研究特別是針對β-HCH的研究較少。

本文選取已穩定運行超60 d的用于降解β-HCH的人工濕地模型，采集植物根際泥水混合物，進行富集篩選分離β-HCH降解菌，以期得到對β-HCH降解能力強且具有耐藥性的優勢細菌。并探究了時間、菌株投加量和復合菌群對β-HCH的降解效果，為實際工程應用提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 菌源

通過從本課題組試驗結果得知：種植美人蕉的人工濕地模型對β-HCH降解效果最佳[15]，于是從已建立的用于β-HCH降解研究穩定運行超60 d的人工濕地模型裝置微宇宙系統中，采集美人蕉根區的泥水混合物，進行富集培養。

1.2 材料

富集培養基：蛋白胨0.6 g，NaCl 0.1 g，KH2PO40.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH7。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.4～pH7.6。

高氏1號培養基：可溶性淀粉2 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，KNO30.1 g，NaCl 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～pH7.4。

馬丁氏培養基：KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，向1 000 mL培養液中加入質量分數為1%的孟加拉紅水溶液3.3 mL。臨用時以無菌操作在100 mL培養基中加入1%的鏈霉素0.3 mL，使其終質量濃度為30 μg·mL-1。

不含碳不含硫無機鹽培養基：KH2PO42 g，NH4Cl 1 g，K2HPO47.5 g，NaCl 0.5 g，MgCl 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然[16]。

β-HCH混合標準溶液購自農業部環境質量監督檢測測試中心；正己烷、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均為色譜純，硝酸混合標準溶液、無水硫酸鈉為分析純，購自天津光復精細化工研究所；甲醇為色譜純，購自西隴化工股份有限公司。

1.3 菌株的篩選

富集：將植物根區的泥水混合物充分振蕩搖勻后，吸取1 mL至100 mL富集培養基中，并作純培養液空白對照，平行3組。在30 ℃、200 r·min-1恒溫搖床培養箱中富集培養48 h得到懸濁液。

分離純化：將待測的懸濁液按照10倍梯度稀釋法進行稀釋，其中細菌的培養稀釋度為10-4、10-5、10-6，放線菌的培養稀釋度為10-3、10-4、10-5，真菌的培養稀釋度為10-1、10-2、10-3，做3次平行試驗。細菌、放線菌和真菌分別采用牛肉膏蛋白胨固體培養基、高氏一號固體培養基和馬丁氏固體培養基培養。在恒溫培養箱中，細菌在37 ℃下培養24 h，放線菌在30 ℃下培養5 d，真菌在30 ℃下培養4 d。將生長成較為單一但顏色、形態等特征不同的菌落挑出，繼續用上述分離培養基劃線分離，直至每一個培養基均為單一菌種培養基。

1.4 菌株的鑒定

菌株DNA的提取、PCR擴增及純化、測序等操作過程，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行，并通過MEGA 4.0軟件將基因序列構建系統進化樹。

1.5 菌液前處理方法

菌液在14 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，再對上清液采用0.45 μm玻璃纖維濾膜抽濾，濾后菌液按體積比100∶1加入甲醇，用硝酸調節至pH<2。用10 mL乙酸乙酯/二氯甲烷(體積比1∶1)混合溶液、10 mL甲醇和10 mL超純水依次活化C18柱，活化后以10 mL·min-1流量將濾后水樣連續通過C18柱，再用10 mL超純水淋洗C18柱，氮氣加壓干燥小柱40 min。用6 mL乙酸乙酯/二氯甲烷(體積比1∶1)混合液分兩次洗脫目標組分，收集洗脫液，高純氮氣吹至近干，正己烷定容至1 mL，混勻待測[17]。

1.6 色譜分析與質量控制

儀器：采用配備電子捕獲器(electron capture detector,ECD)的氣相色譜儀(Clarus 600)。

色譜條件：起始柱溫為80 ℃，以8 ℃· min-1的速度升至210 ℃，保持2 min，以2 ℃· min-1的速度升至230 ℃，保持2 min。進樣口、檢測器溫度分別為280 ℃、320 ℃。

載氣：高純氮氣；不分流進樣1 μL；柱流量為0.6 mL·min-1。

運用氣相色譜-電子捕獲器(gas chromatography-eletron capture detector，GC-ECD)對樣品進行測試分析，根據外標校正曲線法進行定量(R>0.995)。菌液樣空白加標回收率為82.2%～102.2%。

2 結果與討論

2.1 馴化及結果

挑取反復分離純化后的單一菌落，接種于無機鹽液體培養基中，使培養基β-HCH質量濃度為10 μg·L-1，在30 ℃、200 r·min-1條件下培養，7 d后轉接至含β-HCH質量濃度為15 μg·L-1的無機鹽液體培養基，再過7 d測定培養基內β-HCH剩余質量濃度，得到對β-HCH降解效果最佳的3株菌。將這3株菌分別命名為B、F、J。

2.2 菌株降解β-HCH效果分析

菌株純化結束后，平板上挑取典型菌落，接種于牛肉膏蛋白胨培養基中進行擴增培養，采用微孔板分光光度計測量波長為600 nm的光密度(optical density，OD)，待其長到OD600=0.5～0.6，取各菌種培養液10 mL于7 000 r·min-1離心10 min，丟棄上清液，用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)反復沖洗2～3次，重懸于同等體積的無菌PBS中，作為降解菌液備用。以1%的接種量將各菌株分別接種至含有β-HCH(10 μg·L-1)的100 mL無機鹽液體培養基和含有β-HCH(100 μg·L-1)的100 mL無機鹽液體培養基中，每組均加入1 g酵母浸出粉作為輔助碳源，在30 ℃、200 r·min-1條件下搖床培養，采用微孔板分光光度計連續5 d測量每瓶菌液OD600，5 d后取出測定β-HCH剩余質量濃度。結果如圖1和圖2所示。

(a) 10 μg·L-1 β-HCH環境下菌株的生長曲線 (b) 100 μg·L-1 β-HCH環境下菌株的生長曲線

由圖1可見：B菌株在10 μg·L-1β-HCH環境下比在100 μg·L-1β-HCH環境下生長速率更快；F菌株在10 μg·L-1β-HCH環境下于第4天停止增長，在100 μg·L-1β-HCH環境下第3天停止生長；J菌株在10 μg·L-1和在100 μg·L-1β-HCH環境下均于第4天進入穩定期，但J菌株在10 μg· L-1β-HCH環境下的生長速率于第2天后明顯比100 μg·L-1β-HCH環境下要低，并且5 d后最終菌株數量也低于100 μg·L-1β-HCH環境下的菌株數量，由此說明，B、F和J這3株菌均因為β-HCH質量濃度的提高受到了一定程度的抑制。由圖2a可知：3株菌5 d后對10 μg·L-1的β-HCH的平均降解率達66.31%、67.38%和62.68%。圖2b中，3株菌5 d后對100 μg·L-1的β-HCH的平均降解率分別達61.61%、64.07%和59.26%。3株菌對10 μg·L-1、100 μg·L-1的β-HCH降解率差距不大，酵母浸出粉能顯著提高菌株的生長速率[18]，富鍺酵母蛋白粉對不同的菌株有一定的增菌效果[19]，可縮短反應時間[20]。由此認為試驗組內所生長的菌株已足夠降解培養基內溶解的β-HCH。

2.3 不同時間菌株對β-HCH的降解

為了探究不同時間降解菌對β-HCH的降解效果，以及培養基對β-HCH的吸附作用，共設置10組試驗：①(B+培養基)×3瓶，②(F+培養基)×3瓶，③(J+培養基)×3瓶，④培養基×3瓶，⑤超純水×3瓶，①～⑤組均設置β-HCH質量濃度為10 μg·L-1；⑥(B+培養基)×3瓶，⑦(F+培養基)×3瓶，⑧(J+培養基)×3瓶，⑨培養基×3瓶，⑩超純水×3瓶，⑥～⑩組均設置β-HCH質量濃度為100 μg·L-1。

采用2.2中的方法制備降解菌液，并以1%的接種量接種至100 mL無機鹽液體培養基中，每組均加入1 g酵母浸出粉作為輔助碳源，在30 ℃、200 r·min-1條件下搖床培養，分別于第2天、第3天和第5天在①～⑩組中各取出1瓶，測量OD600，并檢測培養基內剩余β-HCH的質量濃度。結果如圖3和圖4所示。

(a) 菌株生長曲線 (b) 菌株對β-HCH的降解率

由圖3a可見：B、F菌株在10 μg·L-1β-HCH環境下生長至第3天后進入穩定期，J菌株在10 μg· L-1β-HCH環境下生長至第2天后開始衰亡期。由圖4a可見：B、F和J在100 μg· L-1β-HCH環境下第2天后進入穩定期，并且B、F這2株菌在10 μg·L-1β-HCH環境下比在100 μg·L-1β-HCH環境下生長數量高，也說明β-HCH質量濃度的提高對B、F這2株菌有一定程度的抑制作用。研究表明：藥品及個人護理用品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)初始濃度越高，對菌株生長抑制效果越明顯[21]，阿特拉津、有機磷農藥初始濃度的升高會抑制降解菌的生長[22-23]。

由圖3b可見：B、F和J菌株在10 μg·L-1β-HCH環境下，第2天對β-HCH的平均降解率達到約44.31%，43.21%和46.54%，均于第3天達到平均降解率最高值，約54.95%、49.49%和46.88%，與兩種菌株的對數生長期相對應。由圖4b可見：B、F和J菌株在100 μg·L-1β-HCH環境下，也是在第2天對β-HCH的降解率達到峰值后下降。且菌株無論是在10 μg·L-1β-HCH環境下還是在100 μg·L-1β-HCH的環境下，待菌株進入衰亡期后，降解率均有所下降。由此說明，菌株對β-HCH的降解主要在對數生長期，在菌株進入穩定期甚至衰亡期后，菌株的死亡可能造成了菌株體內β-HCH的釋放，導致進入穩定期和衰亡期的試驗組β-HCH檢測含量較對數期更高。文獻[24]研究表明：降解菌主要是在對數生長期降解，因為菌株的擴增對其污染物進行降解，后期碳源不足，菌株自溶死亡。如圖3b和圖4b空白對照所示，10 μg·L-1β-HCH環境下和100 μg·L-1β-HCH環境下的培養基與超純水都沒有對菌株生長形成污染，但培養基對10 μg-1L β-HCH的平均降解率較超純水平均高約18.61%，對100 μg·L-1β-HCH的平均降解率較超純水平均高約24.06%，說明培養基會吸附部分β-HCH。

2.4 菌株接種量對降解β-HCH效果的影響

為了確定不同降解菌接種量對β-HCH降解效果的影響，采用2.2中的方法制備降解菌液，每組均加入1 g酵母浸出粉作為輔助碳源，設置11組試驗：①0.1 mL B+培養基；②0.5 mL B+培養基；③1.0 mL B+培養基；④0.1 mL F+培養基；⑤0.5mL F+培養基；⑥1.0 mL F+培養基；⑦0.1 mL J+培養基；⑧0.5 mL J+培養基；⑨1.0 mL J+培養基；⑩培養基對照；超純水對照。β-HCH質量濃度均設置為100 μg·L-1。在30 ℃、200 r·min-1條件下搖床培養，連續5 d采用微孔板分光光度計測量每瓶菌液OD600，5 d后取出測定培養基內β-HCH剩余質量濃度。結果如圖5～圖7所示。

(a) 菌株生長曲線 (b) 菌株對β-HCH的降解率

由圖5和圖6可見：B、F菌株的生長速率均是接種量越高生長速率越快，6個試驗組于第3天左右進入穩定期，第3天后B菌株生長曲線下降速率接種量為0.5 mL的試驗組小于接種量為1 mL和0.1 mL的試驗組，對應B菌株3個試驗組對β-HCH的降解率，說明B菌株接種量為0.5 mL時對β-HCH降解效果最佳。第3天后F菌株接種量為1 mL的試驗組直至試驗結束一直處于穩定期，菌株仍有少量的增長，接種量為0.1 mL和0.5 mL的試驗組于第3天后菌株生長量呈下降趨勢，至試驗結束，接種量為1 mL的試驗組OD600大于接種量0.5 mL和0.1 mL的試驗組，對應F菌株3個試驗組對β-HCH的降解率，說明F菌株接種量越高對β-HCH的降解效果最佳。

(a) 菌株生長曲線 (b) 菌株對β-HCH的降解率

由圖7可見：J菌株生長速率同樣是接種量越高生長速率越快，接種量為0.1 mL和1.0 mL的試驗組于第4天后完全進入穩定期，接種量為0.5 mL的試驗組在試驗周期內一直在生長，沒有進入衰亡期。接種量為1 mL的試驗組降解率大于接種量為0.5 mL和0.1 mL的試驗組，但3組對β-HCH的降解率差距不大，說明J菌株降解β-HCH時，接種量越高對β-HCH的降解效果越好。研究表明：Sphingobiumpaucimobilis降解HCH異構體的降解效率時，反應72 h后，提高接種量的試驗組中，菌株對α-、β-、γ-和 δ-HCH 的降解率均明顯提高[25]，產漆酶血紅密孔菌對城市污泥堆肥過程中有機氯農藥的降解效應表明供試菌劑劑量大小對HCH不同異構體降解效果不盡相同[26]。以上的菌株接種量均大于1%，本試驗中菌株接種量對其降解β-HCH效果影響不明顯，有可能是接種量過低導致。

2.5 復合菌群降解β-HCH效果分析

為了探究復合菌群對β-HCH降解效果的影響，分別將B、F和J這3株菌以相同的體積比和不同的體積比混合，再以1%的接種量接種至100 mL無機鹽液體培養基中，共設置兩組試驗。第1組：①V(B)∶V(F)∶V(J)=1∶1∶2；②V(B)∶V(F)∶V(J)=1∶2∶1；③V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶1∶1；④V(B)∶V(F)∶V(J)=1∶2∶2；⑤V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶1∶2；⑥V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶2∶1；⑦培養基對照；⑧超純水對照。第2組：①V(B)∶V(F)∶V(J)=1∶1∶1；②V(B)∶V(F)∶1∶1；③V(B)∶V(J)=1∶1；④V(F)∶V(J)=1∶1；⑤培養基對照；⑥超純水對照。均設置β-HCH質量濃度為100 μg·L-1。每組均加入1 g酵母浸出粉作為輔助碳源，在30 ℃、200 r·min-1條件下搖床培養，連續5 d采用微孔板分光光度計測量每瓶菌液OD600，5 d后取出測定培養基內β-HCH剩余質量濃度。結果如圖8和圖9所示。

(a) 菌株生長曲線 (b) 菌株對β-HCH的降解率

由圖8和圖9可見：B、F和J這3株菌株以不同比例和相同比例構建的復合菌群均在第3天后進入穩定期，但其生長速率以及試驗結束后剩余的菌株含量對β-HCH的降解率沒有明顯影響。如圖8b所示，3株菌以不同比例復配時，投入B菌株比例為1時，V(B)∶V(F)∶V(J)= 1∶2∶1降解效果最佳，投入F菌株比例為1時，V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶1∶2降解效果最佳；投入J菌株比例為1時，V(B)∶V(F)∶V(J)=1∶2∶1降解效果最佳；全部不同比例復合菌群對β-HCH降解效果最佳比例為V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶1∶2。

文獻[27]研究表明：單一菌種對有機污染物降解能力往往低于復合菌群，這會使得復合菌群具備優于單一菌種生長情況。文獻[28]研究發現：單菌種培養降解磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SMX)降解率僅為0.2%～1.5%，而將生物降解效果最好的4種菌混合培養降解 SMX，降解率提升了約4.2倍，顯著提升了其降解效果。如圖9b所示，相同比例復合菌群對β-HCH降解效果最佳的試驗組比例為V(F)∶V(J)=1∶1。試驗組V(B)∶V(F)∶V(J)= 2∶1∶2對β-HCH的平均降解率為57.66%，而V(F)∶V(J)=1∶1對β-HCH的降解率為46%。由此可得：復合菌群V(B)∶V(F)∶V(J)=2∶1∶2對β-HCH的降解效果最佳。但復合菌群的降解效果并未超過單菌，可能是由于降解菌株之間存在拮抗作用。

2.6 菌種鑒定

將以上3株降解菌用試劑盒提取基因組DNA后，進行特異引物PCR擴增，DNA電泳檢測結果見圖10，PCR電泳檢測結果見圖11。

圖10 β-HCH降解菌DNA電泳檢測結果圖

圖11 β-HCH降解菌PCR電泳檢測結果圖

由圖10可見：3株降解菌的基因組DNA條帶不清晰，DNA有較明顯的降解現象，樣孔干凈，證明DNA樣品沒有被蛋白質污染。由圖11可見：擴增條帶清晰，說明這3株菌純度較高，PCR擴增效果好。

3株菌株進行16S rDNA菌種鑒定后，獲得菌種序列。經鑒定，B菌屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)，疑似為中間蒼白桿菌(Ochrobactrumintermedium)，其分類單元為：細菌界(Bacteria)；變形菌門(Proteobacteria)；丙酸桿菌綱(Alphaproteobacteria)；根瘤菌目(Rhizobiales)；布魯氏菌科(Brucellaceae)；蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)。F菌與B菌同屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)，分類單元相同。J菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，疑似為淺黃假單胞菌(Pseudomonasluteola)，其分類單元為：細菌界(Bacteria)；變形菌門(Proteobacteria)；γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)；假單胞菌目(Pseudomonadales)；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)；假單胞菌屬(Pseudomonas)。

B菌菌落呈白色，半透明，表面光滑水狀，隆起，易挑起。F菌菌落較大，為白色，不透明，菌絲細長呈絲狀交織，不規則，隆起，易挑起。J菌菌落呈淡黃色，表面較粗糙，不透明，隆起，不易挑起。有文獻從農業土壤中發現兩個假單胞菌具有γ-六氯環己烷降解能力[29]，蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)對有機氯農藥DDT具有一定降解能力[30]。

3 結論

(1)從用于降解β-HCH的人工濕地美人蕉根際泥水混合物中篩選分離得到3株優勢降解菌，經分子生物學鑒定分屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。

(2)β-HCH質量濃度升高會顯著抑制菌株的生長速率。

(3)菌株在對數生長期對β-HCH的降解率達到整個降解周期的峰值。

(4)培養基對β-HCH有一定程度的吸附作用，純水中的β-HCH損失是光解和自然揮發所致。

(5)本試驗中，復合菌群對β-HCH降解效果不理想。

本研究篩選出了較好耐藥性的菌株，但是對于其對β-HCH的降解機理和降解產物并沒有特別深入的研究。本研究結果可為實際工程應用提供基礎數據支撐，為優化人工濕地系統，進一步提升人工濕地對β-HCH的降解能力提供技術參考。本文僅選取了一種HCHs的異構體進行研究，可以進一步進行對于其他異構體的研究，以便為人工濕地去除有機氯農藥提供多種支持。