體外亞硝化模擬體系優選阻斷NPYR生成的復合香辛料精油配比

陳文靜,任小青,楊 華,馬儷珍,*

(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384; 2.天津農學院動物科學與動物醫學學院,天津 300384)

近年來,隨著我國經濟實力的迅速增長,食品加工行業的安全問題也愈來愈被重視。在肉制品的加工領域,亞硝酸鹽作為食品添加劑被廣泛使用,這是因為亞硝酸鹽可以使肉制品呈現穩定的紅色,抑制有害細菌的生長繁殖,并且在貯藏過程中可以抑制產品中脂類的氧化,進而延緩食品的腐敗,還可以改善肉類的風味[1-2]。但是,亞硝酸鹽在弱酸性條件下,極易與腌肉制品中富含的蛋白質分解產物——胺類化合物發生亞硝化反應,最終生成具有致癌致畸致突變的危害物(N-亞硝胺)[3]。因此,在腌肉制品加工中,常常通過添加亞硝化抑制劑來減少或抑制N-亞硝胺的生成[4]。

目前,國內外對于如何控制N-亞硝胺的形成研究主要集中在尋找天然亞硝化抑制劑,如VC、VE、茶多酚[5]、香辛料精油(Spices essential oil,SEO)[6-8]等,其中SEO不僅具有獨特的氣味,可以矯味、增色,還具有抑菌、防腐、抗氧化等作用[9-11]。SEO阻斷N-亞硝胺的機理是利用其抗氧化成分(如醛類、醇類、烯類等),通過反硝化途徑,將亞硝化試劑N2O3還原為N2、NO等,進而有效清除亞硝酸鹽殘留量,阻斷N-亞硝胺的生成。黃建蓉等[12]研究發現,花椒精油與八角精油按一定比例復配后,其對亞硝酸鈉的清除能力具有協同增效作用。尹立輝等[8]研究發現,0.2%的八角精油和0.2%的丁香精油對臘腸中N-二甲基亞硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)的阻斷率分別為87%和79%。汪思順等[13]將3.81 mL的大蒜提取液分別加入到腌肉和腌魚中,其對亞硝酸鹽的清除率為85.04%和80.79%。丁城等[14]研究發現50 mL 2%的辣椒提取液對亞硝酸鹽的清除率高達98.6%。

前期研究中,考慮到NDMA是N-亞硝胺中毒性很強的一種,且我國在GB 2762-2017《食品安全標準 食品中污染物限量》中對NDMA限量做出了規定,肉及肉制品(肉制罐頭除外)中含量不得超過3.0 μg/kg,所以本實驗室將優選的阻斷NDMA生成的復合香辛料精油(Compound spices essential oil,CSEO)[15]應用到西式培根加工中,發現其可以顯著降低西式培根中NDMA以及其他幾種N-亞硝胺的含量[16]。但是,西式培根產品中N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)的含量偏高(3.89～7.39 μg/kg),雖然我國未頒布相應的標準規定肉及肉制品中NPYR的含量,但美國食品藥品監管局規定在美國市場上銷售的肉制品所含有的NPYR不得超過10 μg/kg[17]。因此,從保證西式培根的安全品質考慮,本試驗以阻斷NPYR的形成為考核目標,篩選能夠有效阻斷NPYR的CSEO。

響應面設計法[18-20]是利用合理的試驗設計方法并通過試驗得到數據,采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系,通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數,解決多變量問題的一種統計方法。本研究采用單因素實驗和響應面中心組合試驗設計相結合的方法,先從肉制品中常用的8種市售SEO(花椒、八角、青花椒、丁香、迷迭香、黑胡椒、姜油、當歸風味生姜、砂仁)中選出對NPYR抑制率較好的5種,再用響應面中心組合試驗設計篩選出這5種SEO的最佳配比。最后,將優選的CSEO進行驗證試驗,除對NPYR的抑制效果外,也同時考察了對NDMA的抑制率,目的是為CSEO將來在西式培根等腌肉制品中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售常用的8種超臨界萃取SEO(花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油、迷迭香精油、黑胡椒精油、當歸風味姜油、砂仁精油) 天津市春合科技開發有限公司;乳化劑(PEG8000)、檸檬酸鈉、鹽酸、α-萘胺、無水乙醇、無水對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

STARTER3100酸度計 美國Ohaus公司;18Basic勻漿機 德國IKA公司;XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實業發展有限公司;NO.NU-425-400E超凈工作臺 天美(中國)科學儀器有限公司;T6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外模擬亞硝化乳化體系的制備 參照馬儷珍等[21]的方法,并稍作修改。按照試驗設計,分別吸取不同體積的SEO至50 mL帶螺帽的離心管內,均加入0.05 g PEG8000,再加入一定體積的0.5 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH3.0),使其總體積為10.0 mL。用勻漿機B擋(13000 r/min)乳化處理1 min后,取1.0 mL配制好的乳液至50 mL帶螺帽的離心管中,依次加入0.5 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH3.0)5.0 mL,1 mmol/L亞硝酸鈉0.5 mL,1 mmol/L吡咯烷鹽酸鹽0.5 mL,3 mL的緩沖液,使反應體系的總體積為10.0 mL,在37 ℃下水浴反應1 h。

1.2.2 NPYR的測定方法 按照1.2.1體外模擬亞硝化反應結束后,參照馬儷珍等[21]的方法,取1.0 mL反應的溶液至玻璃試管中,加入0.5%碳酸鈉溶液0.5 mL終止其反應,將其置于超凈工作臺內的15 W紫外燈下照射15 min(試管液面距燈管之間的距離為15 cm),取出立即依次加入1%對氨基苯磺酸1.5 mL(搖勻)、0.1%α-萘胺1.5 mL(搖勻)、0.5 mL緩沖液至溶液體積精確至5.0 mL,搖勻,靜置15 min 顯色后在波長525 nm下比色測定其吸光度。

1.2.3 單因素實驗 研究不同體積濃度的8種SEO乳液對NPYR的抑制率。按1.2.1的方法將8種SEO分別吸取0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每種SEO在體外模擬亞硝化反應中的終濃度分別為0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L,反應結束后,按1.2.2進行NPYR的測定,空白對照組為不加香辛料精油的空白乳液,計算每一種SEO在對應體積濃度時對NPYR的抑制率,試驗重復3次。

1.2.4 響應面中心組合試驗設計 在單因素實驗結果的基礎上,最終以花椒精油體積濃度(A,330.0～470.0 μL/L)、八角精油體積濃度(B,300.0～370.0 μL/L)、青花椒精油體積濃度(C,13.0～20.0 μL/L)、丁香精油體積濃度(D,10.0～17.0 μL/L)和迷迭香精油體積濃度(E,100.0～170.0 μL/L)為影響因素水平,以NPYR抑制率為響應值,使用Design-Expert 7.0軟件,依據中心組合試驗設計原理設計響應面優化分析試驗。因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平編碼值Table 1 Response surface test factors and level coding values

1.2.5 驗證試驗 按照1.2.4將響應面中心組合試驗設計得出的CSEO最優配比添加到體外模擬NPYR形成的體系中,進行6次重復驗證試驗。為了解所優選CSEO對NDMA的抑制效果,也同時測定了CSEO對體外模擬體系中NDMA形成的抑制率。

1.2.6 NPYR和NDMA抑制率的計算

式中:A0為不加入SEO的空白乳液時的吸光度值；Ax為加入SEO乳液時的吸光度值。

1.3 數據處理

用 Microsoft Excel 2010對試驗數據進行預處理,Statistix 8.1進行數據分析,通過Turkey test程序進行顯著性差異(P<0.05),Sigmaplot 10.0作圖。響應面試驗采用Design-Expert 7.0設計并進行結果分析,通過建立回歸方程、繪制等高線和響應面圖,對任意兩種因素的交互效應進行分析評價。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

8種不同添加濃度SEO對NPYR抑制率變化見表2。由表2可知,除砂仁精油外,其他7種SEO對NPYR的形成均有不同程度的抑制效果。其中,迷迭香精油對NPYR的抑制率最強,在0.5～20.0 mL/L的體積濃度范圍內,隨著體積濃度的增加,抑制作用也顯著增強(P<0.05)；花椒精油在0.5～20.0 mL/L的體積濃度范圍內,從0.5 mL/L增加到5.0 mL/L時,對NPYR的抑制率從57.93%迅速增加到74.76%(P<0.05),之后隨著體積濃度的增加,抑制率僅有很小幅度的升高(從74.76%升高到77.52%),說明花椒精油在5.0～10.0 mL/L體積濃度就可以達到較好的抑制效果；而當青花椒精油的體積濃度僅為0.5 mL/L時,對NPYR的抑制率就已達到79.37%,若體積濃度繼續增加,則對NPYR抑制率反而呈降低趨勢；丁香精油和八角精油在0.5～15.0 mL/L的體積濃度范圍內,對NPYR的抑制率與其濃度均呈現正相關關系；黑胡椒精油體積濃度從0.5 mL/L增加到5.0 mL/L時,對NPYR的抑制率從15.70%迅速增加到45.23%(P<0.05),之后隨著體積濃度的增加,抑制率反而呈顯著降低趨勢(P<0.05)；當歸風味姜油與黑胡椒精油的變化趨勢基本一致。

表2 8種不同濃度香辛料精油添加對NPYR抑制效果Table 2 Inhibition effect of 8 different concentrations of essential oils on NPYR

由于SEO風味醇香濃厚,單一使用某一種SEO需要較高的濃度(除青花椒精油外,花椒精油、八角精油、迷迭香精油、丁香精油的體積濃度應在15.0 mL/L以上,如表2所示)才能對NPYR的抑制率達到組內最大值,然而在實際應用中要考慮到產品的復合風味,不可能添加如此高濃度的單一SEO。此外,雖然當歸風味姜油在每一個體積濃度上,對NPYR的抑制率都高于八角精油,但是當歸添加到肉制品中的風味微苦,而八角是肉制品加工中常用的一種香辛料,具有廣泛的應用價值[22],所以最終確定在響應面中心組合試驗設計中,以花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油為自變量進行響應面優化試驗。這5種超臨界萃取SEO復配時零水平的濃度確定原則,主要是根據單因素實驗結果。由表2可知,花椒精油和八角精油的體積濃度在5.0 mL/L左右即可以達到較好的抑制效果；青花椒精油的體積濃度為0.5 mL/L時,抑制效果最佳；丁香精油和迷迭香精油的體積濃度在0.5～5 mL/L之間的抑制效果較好；綜合考慮,最終確定其單因素實驗的體積濃度分別為6.0、5.0、0.25、2.0、2.0 mL/L,在此基礎上因為是5種超臨界萃取SEO復配且超臨界萃取SEO風味濃郁醇厚,所以只選取單因素實驗時體積濃度的1/15,而丁香精油(香氣濃郁)的體積濃度為迷迭香精油最終體積濃度的1/10。最終確定花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油復配時零水平的體積濃度分別為400.0、335.0、16.5、13.5和135.0 μL/L。

2.2 響應面中心組合試驗

以單因素實驗結果為依據,選取花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)5個因素為自變量,使用Design-Expert 7.0軟件,通過中心組合試驗設計原理進行5因素3水平的響應面優化分析試驗,研究其對NPYR抑制率(Y)的影響。

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性檢驗 響應面中心組合試驗設計及結果見表3。

表3 響應面中心組合試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface center combination test

利用軟件Design-Expert 7.0對上述試驗結果進行多元線性回歸分析,可建立抑制率(Y)對花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)的二次回歸方程:Y=70.01+0.013A+0.022B+0.026C+0.031D+0.030E+0.058AB+0.085AC+0.017AD+0.058AE-0.037BC+0.075BD+0.010BE+2.500E-003+0.035CE+0.043DE-0.55A2-0.54B2-0.51C2-0.54D2-0.55E2。

表4 響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test regression model

2.2.2 響應曲面和等高線圖分析 通過Design-Expert 7.0軟件繪制的響應曲面和等高線圖,可以更為直觀地反映出研究因素及其交互作用對NPYR抑制率的影響,響應曲面圖中曲線彎曲度越大,說明研究因素對NPYR抑制率影響越大[28-29]；等高線呈現橢圓形,則說明研究的各因素之間交互作用顯著,而圓形則說明交互作用不顯著[30-31]。通過擬合模型的回歸方程所作的各因素之間交互作用的響應面分析見圖1所示。如圖1所示,花椒精油和青花椒精油之間的交互作用顯著,將花椒精油的體積濃度固定后,NPYR抑制率隨著青花椒體積濃度的升高呈現先增加后降低趨勢,且其等高線圖呈橢圓形,青花椒精油的體積濃度一定時,NPYR抑制率隨著花椒精油體積濃度的增加先升高后降低。圖1顯示,八角精油和丁香精油之間的交互作用也達到了顯著水平(P<0.05),當八角精油在一定體積濃度時,對NPYR的抑制效果隨著丁香精油體積濃度的增加先升高后降低,反之,也呈現相同的變化趨勢。這就說明,花椒精油和青花椒精油、八角精油和丁香精油之間的交互作用對NPYR的抑制作用都比較大,該分析結果與方差分析結果一致。

圖1 花椒和青花椒、八角和丁香精油相互作用對NPYR抑制率的響應面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of the interaction between pepper and green pepper,star anise and clove essential oil on NPYR inhibition rate

2.2.3 最佳工藝條件預測與驗證試驗 根據Design-Expert 7.0軟件預測得出抑制NPYR的CSEO最優配比,為花椒精油441.0 μL/L、八角精油337.0 μL/L、青花椒精油17.0 μL/L、丁香精油14.0 μL/L和迷迭香精油137.0 μL/L。此時,NPYR抑制率的預測結果為69.84%。將此條件下的CSEO在體外模擬NPYR形成的體系中進行驗證試驗,試驗測得NPYR抑制率為68.40%±0.33%,與預測值基本相符,說明運用響應面法優化得到的模型參數準確可靠,具有實際應用價值。再將此最優配比在體外模擬NDMA形成的體系中進行驗證試驗,試驗測定對NDMA抑制率為66.69%±0.43%。

本試驗采用響應面中心組合設計得到的最優配比,對NPYR的抑制率為68.40%±0.33%(驗證試驗值)。此結果比單因素實驗中最高的NPYR抑制率(迷迭香的體積濃度為20.0 mL/L,對NPYR的抑制率為85.70%)要略低,這是因為考慮到在肉制品的實際生產加工中SEO添加量對肉制品風味的影響,篩選的最優配比中各SEO的體積濃度均遠低于使用單一SEO時的最高濃度。

3 結論

單因素實驗結果表明,在體外模擬亞硝化體系中,除砂仁精油外,其他7種SEO對NPYR的生成均有不同程度的抑制作用,抑制率大小與其添加濃度有一定關系。響應面中心組合設計試驗得到由5種SEO組合的CSEO,最優體積濃度配比為:當花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油的體積濃度分別為441.0、337.0、17.0、14.0和137.0 μL/L時,由模型優選得出對NPYR抑制率的預測值為69.84%,驗證試驗得出的抑制率為68.40%±0.33%,說明得到的模型與實際擬合度較好,具有實用價值。此配比對NDMA的抑制率為66.69%±0.43%。