基于標準物質評價平板計數瓊脂培養基的生長率

郭 蕓,劉思淵,隋志偉,王梓權,王 斌,朱 文,林 婧,李海濤

(1.山西藥科職業學院,山西太原 030031; 2.中國計量科學研究院前沿計量科學中心,北京 100029; 3.南京市計量監督檢測院,江蘇南京 210049 4.山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006)

食品是人類生存和發展的物質基礎,食品安全問題也越來越受到社會廣泛的關注。食源性病原微生物是引起食品安全問題的主要因素之一。目前,我國現行的食品微生物檢驗標準為GB4789系列《食品安全國家標準食品微生物學檢驗》[1],標準中的檢驗方法都是以傳統微生物學培養為基礎的經典檢驗方法。培養基是方法中所必須采用的生化試劑,其質量直接影響食品微生物檢驗結果的準確性[2],因此,培養基的質量控制十分重要[3]。

菌落總數是食品微生物檢測中最基本、最常見的檢測項目[4]。平板計數瓊脂(plate count agar,PCA)培養基作為檢測菌落總數所用培養基,也廣泛用于我國的微生物實驗室[5-7]。PCA培養基的質量控制包括外觀、溶解性能、pH、水分等物理指標及生長率等微生物指標,其中,生長率是PCA培養基質量控制的關鍵指標之一[8]。根據杜宗緒[8]研究,質控菌株在不同品牌的PCA培養基上的生長率存在差異。因此,有效的生長率評價方法是確保菌落總數檢測結果準確性的有效手段之一。

根據GB4789.28-2013《培養基和試劑的質量要求》及相關標準[9-10],評價PCA培養基生長率需要使用質控菌株。評價前,質控菌株需要復蘇和培養;評價時每個平板的接種水平為20～200 CFU;此外質控菌株還需要接種到參比培養基上進行培養。于瑞莉等[8，11-12]參照標準,對不同品牌PCA培養基的生長率進行了評價。然而,現行的評價方法存在四方面的缺陷。第一,質控菌株的復蘇和培養需要較長的時間。第二,參比培養基的制備和質量控制需要花費較多的工作量。第三,質控菌株的接種量難以做到精確的控制,實驗室內部難以重復,方法的重復性有待提高。第四,實驗的地點、方法、人員、器具、材料都有可能對生長率評價結果產生影響[13-14]。而根據《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[15],微生物樣本的運輸存在很大的限制。因此,國標方法難以用于不同實驗室同時進行培養基評價,方法的再現性有待提高。

標準物質是具有均勻且既定的特性值,用以測量裝置校準、測量方法評價或材料賦值的一種材料或物質[16-17]。目前,微生物領域的標準物質在能力驗證、儀器校準、方法評價等方面有著廣泛的用途[18-19],其在培養基生長率評價方面也有較大的應用前景。

綜上所述,本研究選用大腸桿菌作為評價菌株,將其制備成量值均勻穩定的標準物質,建立一種使用標準物質評價PCA培養基生長率的方法,并對方法的實驗室內重復性和實驗室間再現性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCA培養基品牌 北京陸橋、廣東環凱、青島海博、北京奧博星、北京三藥、上海齊一、北京沃凱、美國BD、英國Oxoid(對9個品牌隨機編號,為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9);大腸桿菌(Escherichiacoli,CICC 10389) 中國工業微生物菌種保藏中心;磷酸鹽緩沖溶液(PBS,phosphate buffered solution,pH7.2±0.2)、營養肉湯培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基 北京陸橋技術有限責任公司;脫脂奶粉 美國BD公司;海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉、麥芽糊、抗壞血酸鈉 分析純,Sigma公司。

Genesis SQ eL-85型凍干機 SP Scientific公司;BS224S型電子天平、1-14型離心機 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HZQ-X100型恒溫振蕩培養箱 江蘇太倉市實驗設備廠;DNP-9272型恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;去離子水 機默克化工技術(上海)有限公司;HG-50型高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌標準物質的制備 根據本實驗室先前的制備工藝[18]制備大腸桿菌標準物質。將大腸桿菌接種于營養肉湯培養基,37 ℃、200 r/min培養12 h。隨后10000×g離心5 min,棄去上清液,菌泥用PBS重懸并稀釋,得到適宜濃度的大腸桿菌菌液。參考先前的配方[18]配制保護劑,加入大腸桿菌菌液后,將保護劑分裝至棕色西林瓶中。分裝完畢后,將西林瓶轉移至凍干機內進行凍干。凍干結束將樣品壓蓋密封,得到大腸桿菌標準物質。標準物質的測定方法參考GB4789.2-2016《菌落總數測定》[5],使用PCA培養基,采用平板計數方法進行菌落總數測定。

1.2.2 大腸桿菌標準物質均勻性和穩定性評估 參考ISO[20],對標準物質的均勻性和穩定性進行評估。均勻性評估中,隨機抽取11個單元的標準物質進行檢測,每瓶樣品重復檢測3次;穩定性評估中,分別在0、7、38和99 d,每次從-20 ℃隨機選取3個單元的樣品進行檢測。均勻性評估和穩定性評估所使用的PCA培養基均為A8品牌。為了保證標準物質量值的準確可靠,評估前需要參考GB 4789.28-2013《培養基和試劑的質量要求》[10],對A8品牌PCA培養基進行嚴格的質量控制,確保大腸桿菌在該培養基上的生長率大于0.9,高于國標中生長率大于0.7的要求。

1.2.3 大腸桿菌標準物質的定值 依據JJF 1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》[21],標準物質經由10家通過CNAS認可的實驗室合作定值[22]。10家實驗室所使用的PCA培養基包含了A1、A8兩個國產品牌,A4、A5兩個進口品牌,涵蓋了目前市場上常見的培養基品牌。定值前,各家實驗室參考GB 4789.28-2013《培養基和試劑的質量要求》[10],對所用PCA培養基進行質量控制,確保大腸桿菌在培養基上的生長率大于0.9。

1.2.4 PCA培養基生長率評價方法 使用待評價的PCA培養基,對一個單元的大腸桿菌標準物質進行3次測定。根據式(1),計算大腸桿菌在該PCA培養基上的生長率。

式(1)

式(1)中,PR為待測PCA培養基的生長率;NS為三次使用待測PCA培養基測定大腸桿菌標準物質結果的平均值;N0為大腸桿菌標準物質的標準值,為(7.0±1.2)×103CFU/g(見2.2 標準物質的標準值與不確定度)。使用待測PCA培養基測定大腸桿菌標準物質的結果NS應在5.8×103～8.2×103CFU/g之間,因此待測PCA培養基的生長率需滿足0.83≤PR≤1.17。

式(2)

式(4)

式(5)

1.2.7 不同品牌PCA培養基生長率的評價 A1～A9九個品牌可以涵蓋國內幾乎所有微生物實驗室所用品牌。使用9個品牌的PCA培養基以及GB 4789.28-2013《培養基和試劑的質量要求》中的參比培養基(胰蛋白胨大豆瓊脂培養基),分別對3個單元的大腸桿菌標準物質進行測定。根據式(1)進行計算大腸桿菌在PCA培養基的生長率;同時參考國標方法計算其生長率。

1.3 數據處理

利用SPSS 22.0,MS Excel 2013進行數據的統計分析、圖表的制作等。

2 結果與分析

2.1 標準物質的均勻性和穩定性

隨機抽取11個單元的標準物質進行均勻性評估。結果(表1)表明,F=0.89

表1 大腸桿菌標準物質的均勻性Table 1 Uniformity of reference materials of Escherichia coli

式(6)

圖1 標準物質量值與時間的關系Fig.1 The relationship between the value of reference materials and the time

式(7)

2.2 標準物質的定值與不確定度

表2 大腸桿菌標準物質定值結果Table 2 Valuing of the reference materials of Escherichia coli

式(8)

大腸桿菌標準物質的不確定度由3部分組成:第1部分是A類相對標準不確定度urel(A),來源于10家實驗室合作定值;第2部分是B類相對標準不確定度urel(B),包括:移液器帶來的不確定度、樣品稀釋因子帶來的不確定度;第3部分是標準物質不均勻性引入的相對標準不確定度urel(bb)和不穩定性引入的相對標準不確定度urel(s)。將這幾部分相對標準不確定度合成后計算得到標準值的合成不確定度urel(C),及擴展不確定度U(k=2,置信概率95%)。結果(表3)表明,大腸桿菌標準物質的標準值為(7.0±1.2)×103CFU/g。

表3 標準物質不確定度評定Table 3 Uncertainty evaluation of the reference materials

2.3 評價方法的重復性

每天使用大腸桿菌標準物質,對A8品牌PCA培養基的生長率進行3次重復獨立的評價,連續評價3 d,進行重復性驗證。結果如表4所示,A8品牌PCA培養基的生長率的9個獨立結果均滿足0.83≤PR≤1.17。評價方法的重復性相對標準偏差為9.09%。

表4 評價方法的重復性Table 4 Repeatability of the evaluation method

2.4 評價方法的再現性

評價方法的再現性經由6家實驗室進行驗證。每家實驗室使用3個單元的大腸桿菌標準物質,對A8品牌PCA培養基的生長率進行評價。結果如表5所示,測定結果均滿足0.83≤PR≤1.17。評價方法的再現性相對標準偏差為14.42%。

表5 評價方法的再現性Table 5 Reproducibility of the evaluation method

2.5 不同品牌PCA培養基生長率

使用大腸桿菌標準物質,對A1～A9九個品牌PCA培養基的生長率進行評價。結果如圖2所示,使用本研究所建方法進行評價時,待測PCA培養基的生長率均滿足0.83≤PR≤1.17的要求;使用國標方法進行評價時,待測PCA培養基的生長率均大于0.7。本研究所建立的評價方法和國標方法有很好的相關性(R2=1)。此外,不同品牌PCA培養基的生長率存在差異。

圖2 九種品牌PCA培養基的生長率Fig.2 The productivity ratio of nine brands of PCA

3 討論

生長率是PCA培養基質量控制的關鍵指標之一[25]。因此,建立快速高效的生長率評價方法是確保菌落總數結果準確性的有效手段。本研究基于微生物標準物質,建立了一種新的PCA培養基生長率的評價方法。

評價方法所用的大腸桿菌質控菌株以標準物質的形式存在,并且標準物質研制過程中采用了特定的培養基策略。第一,研制的標準物質的用途為評價PCA培養基的生長率,因此選擇PCA培養基作為測定培養基,而非GB 4789.38-2016《大腸埃希氏菌計數》規定的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基[26]。第二,合作定值使用了多個品牌的PCA培養基。第三,均勻性和穩定性評估使用了單個品牌PCA培養基。第四,所用PCA培養基均經過嚴格的質量控制(參考GB 4789.28-2013《培養基和試劑的質量要求》的方法進行評價,生長率大于0.9)。基于所用的培養基選擇策略,研制的大腸桿菌標準物質不僅均勻穩定、易于運輸,其標準值還具有PCA培養基依賴性,這些特點可以滿足PCA培養基生長率評價中對質控菌株的要求。

因此,建立的評價方法可以實現質控菌株接種量的精確控制,解決了現行方法無法實現實驗室內不同時間驗證的缺陷,具有重復性;可以實現多家實驗室間的同時評價,具有再現性。此外,相比于現行方法(表6),本研究建立的基于標準物質的評價方法無需使用參比培養基、無需事先培養質控菌株、無需控制接種量,使得工作量顯著減少,所需時間僅為1 d,具有方便快捷的優點。微生物實驗室可以實現快速高效的PCA培養基質量控制。

表6 評價方法與現行方法的比較Table 6 Repeatability of the evaluation method

評價PCA培養基生長率所用質控菌株通常包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等[10-12]。本研究僅對大腸桿菌在PCA培養基上的生長率進行了討論,所做工作尚不完善。但本研究對培養基生長率的評價提出了一個新的思路,相信隨著微生物標準物質研制水平的不斷進步[27-32],本方法所適用的培養基范圍將會進一步提升。

4 結論

本研究建立了一種基于大腸桿菌標準物質的PCA培養基生長率的評價方法。評價方法的重復性相對標準偏差為9.09%,再現性相對標準偏差為14.42%,具有方便快捷的優點,有望解決現行生長率評價方法的缺陷。相信隨著微生物標準物質研究的不斷推進,培養基的質量控制與監測會越來越標準化和精確化,我國微生物領域與公共衛生領域的研究水平也會不斷提高。