響應面法優化復方降脂片的成型性工藝及其降脂活性

張榮榕,馬馨桐,王 苗,張紅印,衣春光,嚴銘銘,4,*,趙大慶,*

(1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院,吉林長春 130117; 2.長春中醫藥大學藥學院,吉林長春 130117; 3.長春中醫藥大學基礎醫學院,吉林長春 130117; 4.吉林省中藥保健食品科技創新中心,吉林長春 130117)

復方降脂片由三七、丹參、荷葉、山楂四味藥材組成,其中荷葉具有祛濕化濁降脂的功效,山楂、丹參配伍使用具有消食化瘀降脂功效,三七具有良好的活血化瘀、健脾益氣、通脈活絡功效[1-2]。在中國,山楂、荷葉作為藥食同源藥材有長期食用的歷史;丹參、三七長期應用于中醫臨床,且目前收錄于衛生部公布的《可用于保健食品的物品目錄》。以上四味藥材相輔相成,具有化痰濕、暢氣血之功效,且三七-丹參、丹參-山楂均為中醫臨床用藥的常用藥對,其中,丹參、山楂搭配食用降“三高”亦有良好口碑[3-6]。有研究表明丹參-山楂-三七常以角藥形式存在,具有很好的調節血脂作用,故本研究以三七、丹參、荷葉、山楂四味藥材為原料藥,輔以相應輔料,將其開發成具有祛濕化濁降脂、暢氣血之功效的保健食品。

片劑具有劑量準確、質量穩定、產量大、成本低、生產工藝簡單、易于控制、衛生標準易于達到、在運輸和儲存過程中比較穩定、消費者攜帶和食用方便等優勢,在保健食品、食品領域均有廣泛應用[7]。為了更好地開發利用復方降脂方,本課題組將其開發成方便、穩定的中藥片劑。課題組前期已確定復方降脂方的提取工藝,該法所制得的干浸膏粉吸濕性較強,易黏結成塊,因此本文將采用Box-Behnken響應面法對復方降脂片的輔料配方及成型工藝進行優化,以改善浸膏粉的吸濕性,將其開發成質量可控、性質穩定的中藥片劑。同時,使用高脂模型大鼠對復方降脂片降脂活性進行初步研究,旨在研制出一種口感適宜、風味獨特,具有良好降脂活性的復方降脂片,為其后續深入研究、開發及生產應用提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復方降脂提取物干粉 自制;羧甲淀粉鈉 湖州展望藥業有限公司,批號20171236;微晶纖維素 湖州展望藥業有限公司,批號20171239);硬脂酸鎂 安徽山河藥用輔料股份有限公司,批號180229;乙醇 北京化工廠,批號20171013;陽性對照藥辛伐他汀 山東羅欣制藥廠;TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST測定試劑盒 南京建成生物工程研究所(中國江蘇南京);所有其他化學品 均為分析純;Wistar大鼠 體重(180±10) g,雄性,購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司,生產許可證號SCXK(遼)2016-0003,合格證號No.201700017184;動物實驗環境 吉林省長春中醫藥大學藥學實驗樓SPF級動物實驗室,設施使用許可證號SYXK(吉)2010-0059;在動物室中適應7 d,在12 h光暗循環下,將它們保持在受控的環境溫度(24±2) ℃和濕度60%±10%下;隨意獲取水;動物方案經長春中醫藥大學動物倫理委員會批準(吉林長春)[批準號:20171011]。

TDP-1.5單沖壓片機 上海嘉展儀器設備有限公司;YD-1片劑硬度測試儀 天津天光光學儀器有限公司;CS-2脆碎度測定儀 天津市光學儀器廠;BJ-2崩解時限測定儀 天津市國銘醫藥設備有限公司;CP223C電子天平 奧豪斯儀器有限公司;DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;ALB-224萬分之一分析天平 德國賽多利斯公司;Agilent1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;AB265-S十萬分之一分析天平 瑞士梅特勒托利多公司;KQ-250DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UB-7 pH計 Denver Instrument;UV-1700紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復方降脂提取物的提取工藝 按處方稱取荷葉3 g、山楂3 g、丹參2.5 g、三七1.5 g,將以上四味藥材加水煎煮,濃縮得到復方降脂提取物。

1.2.2 復方降脂片的制備工藝 按比例精密稱取主藥、微晶纖維素及羧甲基淀粉鈉,混合均勻后過80目篩,添加潤濕劑制備軟材,14目篩制備顆粒,55 ℃真空干燥箱干燥,16目篩整粒,收集顆粒,加入1.0%硬脂酸鎂,混合均勻,即可壓片,控制片劑硬度在8～10 kg。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 主藥與填充劑比例的確定 按中藥湯劑服用量及復方降脂提取物的出膏率,結合預實驗結果,確定復方降脂提取物添加量為65%～85%(相當于片重為1.0 g的復方降脂片中0.65～0.85 g復方降脂提取物)。以主藥:填充劑分別為65∶30、70∶25、75∶20、80∶15、85∶10進行單因素實驗,固定崩解劑用量為4.5%,潤濕劑為75%乙醇。以顆粒成型性、片劑崩解時限及脆碎度為評價指標確定復方降脂片主藥與填充劑的比例。

1.2.3.2 崩解劑用量的確定 通過預實驗確定羧甲基纖維素鈉作為復方降脂片的崩解劑,固定主藥與填充劑的比例為80∶15,潤濕劑為75%乙醇,以崩解劑的添加用量分別為4%、4.5%、5%、5.5%及6.0%進行單因素實驗。以顆粒成型性、片劑崩解時限及脆碎度為評價指標,確定復方降脂片崩解劑的添加量。

1.2.3.3 乙醇濃度的確定 通過預實驗確定乙醇作為復方降脂片的潤濕劑,固定主藥與填充劑的比例為80∶15,崩解劑的添加量為5%,分別以50%、60%、70%、80%及90%濃度的乙醇為潤濕劑進行單因素實驗。以顆粒成型性、片劑崩解時限及脆碎度為評價指標,確定復方降脂片潤濕劑的濃度。

1.2.4 響應面試驗設計 為了獲得載藥量大、崩解時限適宜、脆碎度合格的片劑,設計響應面試驗對主藥與填充劑比例、崩解劑用量及潤濕劑用量進行了進一步的優選,以期獲得最佳成型性工藝參數。根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,采用三因素三水平的響應面設計法(見表1),確定復方降脂片的最佳提取工藝條件[8]。

表1 響應面實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels design for response surface experiment

1.2.5 綜合評分的計算 為了得到質量穩定,溶出度適宜的片劑,結合預實驗及相關文獻[9],確定了如下的綜合評分計算方法:

綜合評分(%)=[最小脆碎度/X組片劑脆碎度×0.2+最短崩解時限/X組片劑崩解時限×0.2+X組溶出度/最大溶出度×0.6]×100

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 脆碎度的測定 按《中國藥典》第四部通則項下的“片劑脆碎度檢查法”測定復方降脂片的脆碎度,取復方降脂片10片,用吹風機吹去片劑脫落的粉末,精密稱定,置圓筒中,轉動100次。同法除去粉末,精密稱重,減失重量不得超過1%,且不得檢出斷裂、龜裂及粉碎的片。

1.2.6.2 崩解時限的測定 按《中國藥典》第四部通則項下的“崩解時限檢查法”測定復方降脂片的崩解時限,取復方降脂片6片,分別置上述吊籃的玻璃管中,啟動崩解時限儀進行檢查,記錄各片的崩解時限。

1.2.6.3 溶出度的測定 按《中國藥典》第四部通則項下的“溶出度與釋放度檢查法”測定復方降脂片的溶出度,取6片中復方降脂片,以0.1 mol·L-1鹽酸作為溶出介質,轉速100 r·min-1,溫度37 ℃,在10 min時取樣2 mL,0.45 μm微孔濾膜濾過,取續濾液10 μL。以紅景天苷為指標成分,測定其峰面積,計算溶出度。

1.2.7 降脂活性實驗

1.2.7.1 高脂血癥的誘導 參考文獻報道[10-11]設計復方降脂片作用動物實驗研究方案,大鼠正常飼養一周后,喂食高脂飲食(2%膽固醇,15%豬油,10%蛋黃,0.5%膽酸鈉,74.5%維持飼料)(w/w)。四周后,使用血清膽固醇水平>140 mg/dL的高脂血癥大鼠作為實驗動物。

1.2.7.2 動物分組 大鼠84只,隨機分成7組,每組12只,分為正常對照組(NC),給予生理鹽水(10 mL/kg/d);正常給藥組(ND)(復方降脂片治療正常大鼠),劑量為417 mg·kg-1·d-1;高脂模型組(HC),給予生理鹽水(10 mg·kg-1·d-1);高劑量組(GH),劑量為834 mg·kg-1·d-1;中劑量組(GM),劑量為417 mg·kg-1·d-1;低劑量組(GL),劑量為209 mg·kg-1·d-1;陽性對照組(ST)(辛伐他汀,4 mg·kg-1·d-1)。

1.2.7.3 給藥劑量及給藥方式 將復方降脂片溶解于0.9%鹽水中,制成適當濃度的溶液,按照上述給藥量,每只大鼠每天灌胃給藥一次,持續4周。每天觀察大鼠的行為活動,毛皮狀況,水和食物攝入情況。

1.2.7.4 血清指標檢測 給藥結束后,大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射20%烏來糖(0.3 mL/100 g)麻醉動物。從腹部主動脈收集約9～10 mL血樣,將血液樣品以3000 r/min離心15 min,血清樣本使用酶標儀測血清中谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三脂(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density liptein cholesterol,HDL-C)的水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 主藥與填充劑比例的確定 由表2可以看出,處方2、3脆碎度較小,綜合評分較高,處方4崩解時限較小,且顆粒成型率較高,綜上,確定主藥與填充劑比例選范圍為70∶25～80∶15。

表2 主藥與填充劑比例選擇的實驗結果Table 2 Experimental results for the selection of the ratio of main drug and filler

表5 響應面設計方案及結果Table 5 Design and results of response surface experiment

2.1.2 崩解劑用量的確定 由表3可以看出,處方2、3、4脆碎度較小,綜合評分較高,處方3、4、5崩解時限較小,但處方5的綜合評分較低,綜上,確定主藥與填充劑比例選范圍為4.5%～5.5%。

表3 崩解劑用量的選擇實驗結果Table 3 Experimental results of choice of disintegrant dosage

2.1.3 乙醇濃度的確定 由表4可以看出,處方2、3、4脆碎度較小,綜合評分較高,處方1、2崩解時限較大,顆粒成型性較低,綜合評分低。綜上,確定主藥與填充劑比例選范圍為60%～80%。

表4 乙醇濃度的選擇實驗結果Table 4 Experimental results of choice of ethanol concentration

2.2 響應面設計試驗結果

2.2.1 回歸方程擬合及方差分析 將所得實驗數據采用Design-Expert 8.0.5.0軟件進行多元回歸擬合,得到綜合評分對主藥:填充劑(A)、崩解劑比例(B)、乙醇濃度(C)的二元多項回歸方程:

Y=-311.49795+1.48445A+128.49003B+1.90514C-0.97233AB+0.15494AC-0.24250BC-0.86586A2-10.87B2-9.1775×10-3C2

為了檢驗方程的有效性,對綜合評分的數學模型進行了方差分析,由表6可知，綜合評分為響應值時,該二次方程模型極顯著(F=21.49,P<0.0001)回歸方程失擬性檢驗無統計學意義(P=0.0687>0.05),表明未知因素對試驗結果干擾很小;模型的決定系數R2值為0.9651,接近于1,說明該回歸模型與試驗數據擬合度較高,可用此模型對綜合評分進行分析和預測。該方程與實際情況擬合很好,較好地反映了綜合評分與主藥:填充劑比例、崩解劑比例、乙醇濃度三者之間的關系,因此,所得的回歸方程能較好地預測綜合評分隨各參數的變化規律[12-13]。

表6 響應面試驗方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface experiment

由回歸模型和方差分析可知(表6),方程一次項A、B及方程二次項C2對綜合評分的影響達到顯著水平(P<0.05);方程交互項AC、BC及方程二次項A2、B2對綜合評分的影響達到極顯著水平(P<0.01),根據F值可知,各因素對綜合評分的影響的大小順序為:B(崩解劑比例)>A(主藥:填充劑比例)>C(乙醇濃度)。綜合以上各參數表明該試驗方法可靠,各因素水平間設計合理,因此可用該回歸模型代替真實實驗對結果進行分析。

2.2.2 交互作用分析 響應面圖形是響應值對各試驗因子A、B、C、D所構成的三維空間的曲面圖,將兩個因素固定在0水平,經Design-Expert 8.0.5.0軟件分析,觀察剩余兩個因素的交互作用,從圖1中可以看出,最佳參數及各參數之間的相互作用。

圖1 主藥與填充劑比例與崩解劑比例對綜合評分的影響Fig.1 Influence of the ratio of main drug to filler and disintegrant on the comprehensive score

表7 驗證實驗結果Table 7 Verify experiment results

由表6可知,AC、BC兩組因素交互作用極顯著(P<0.01),其等高線圖和響應面圖見圖2、圖3。由圖2可知,隨著主藥與填充劑的比例(A)與乙醇濃度(C)的增加,綜合評分越來越高,達到極值后逐漸下降,且等高線圖呈橢圓形,表明兩者之間交互作用極顯著。由圖3可知,崩解劑的比例(B)與乙醇濃度(C)的等高線呈橢圓形,響應面曲線呈山丘形,隨著崩解劑的比例(B)與乙醇濃度(C)的增加,綜合評分越來越高,達到極值后逐漸下降,表明兩者之間交互作用極顯著,有極大值存在[14-15]。

圖2 主藥與填充劑比例與乙醇濃度對綜合評分的影響Fig.2 Effects of the ratio of main drug to filler and ethanol concentration on comprehensive score

圖3 乙醇濃度與崩解劑比例對綜合評分的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration and disintegrant ratio on comprehensive score

2.2.3 優化結果 在上述響應面模型分析的基礎上,利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對綜合指標的二次回歸方程求解,得最佳工藝條件為A(主藥:填充劑)80∶15、B(崩解劑比例)4.78%、C(乙醇濃度)80%,預測所得的綜合評分為92.63%。

2.2.4 驗證性實驗 為方便實際操作,將響應面實驗最終優化結果修正為A(主藥∶填充劑)80∶15、B(崩解劑比例)5%、C(乙醇濃度)80%。按此工藝條件制備3批復方降脂片,分別測定三批樣品的脆碎度、崩解時限及溶出度,并計算綜合評分(結果見表),各批次樣品綜合評分為94.01%,與預測值相對誤差為1.49%,且脆碎度和崩解時限均符合藥典規定。以上結果表明,該成型性工藝穩定可行。

2.3 降脂活性實驗結果

高脂飼料喂養4周后的大鼠與空白組正常飼料喂養的正常大鼠相比,體重極顯著增加(P<0.01),且與空白組相比,模型組大鼠血清中TC、TG、AST、ALT和LDL-C水平均顯著升高(P<0.05),符合高脂血癥模型的特征,說明本次造模成功(見圖4和圖5)。

圖5 復方降脂片對大鼠血清血脂水平的影響Fig.5 Effects of compound Lipid LoweringTablet on serum blood lipid level in rats

圖4 各組實驗動物體重變化Fig.4 Changes in body weight of experimental animals in each group注:與HC組相比,*表示顯著(P<0.05), **表示極顯著(P<0.01)；圖5同。

與模型組相比,復方降脂片各劑量組大鼠血清中,除高密度脂蛋白(HDL-C)外,其他指標均呈下降趨勢,其中高劑量組各指標水平均呈極顯著下降(P<0.01),中劑量組AST、ALT水平呈極顯著下降(P<0.01),TC、TG及LDL-C的水平顯著下降(P<0.05),說明復方降脂片可以通過抑制大鼠血清中TC、TG、AST、ALT和LDL-C的蓄積,降低高脂血癥大鼠血清中的脂肪含量。實驗結果顯示,正常給藥組大鼠血清的各項指標與空白組基本相同,未觀察到明顯的降低或升高,說明復方降脂片的使用不會導致大鼠體重的異常變化。與模型組相比,辛伐他汀組和復方降脂片高劑量組大鼠血清的HDL-C水平極顯著升高(P<0.01),復方降脂片中劑量組大鼠血清的HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。以上結果表明,復方降脂片具有顯著的降脂作用。

3 討論與結論

高脂血癥是我國老年人群中很常見的慢性疾病、是導致動脈粥樣硬化的危險因素之一,它已經成為我國現目前不可忽視的社會公共衛生問題[16-17]。高脂血癥往往會使機體脂質代謝紊亂,導致血清或肝組織中的HDL-C水平降低或者LDL-C、TG、TC等水平增高[18-20]。為了探究復方降脂片的降脂活性,本研究采用大鼠高脂血癥模型對復方降脂片的降脂活性進行初步研究。實驗結果顯示,給藥4周后,與高脂模型組相比,復方降脂片各劑量組大鼠血清中,除高密度脂蛋白(HDL-C)外,其他指標均呈下降趨勢,其中高劑量組各指標水平均呈極顯著下降(P<0.01)；中劑量組AST、ALT水平呈極顯著下降(P<0.01),TC、TG及LDL-C的水平顯著下降(P<0.05),HDL-C增加,與HC組有顯著差異(P<0.05)。

高脂血癥的治療,西醫常用他汀類和貝特類,雖治療效果肯定,但價格昂貴,且長期服用增加肝功能損害的風險,少數患者可出現轉氨酶升高、腎功損害、胃腸道不適、皮疹、頭痛、失眠、肌炎、甚至橫紋肌肌溶解等不良反應。國內多項研究表明[21-22],中醫藥治療高脂血癥合并脂肪肝有其獨特的優勢。例如,卓冰帆等[23]探討了山荷降脂湯(處方中含有山楂、丹參及荷葉藥材)治療痰濕內阻型高脂血癥的臨床療效,結果表明山荷降脂湯能夠明顯降低血清中LDL、TG、ALT、AST的水平,從而達到降血脂的療效,與本文所研究的復方降脂片療效相似。

復方降脂方在臨床上主要采用傳統湯劑形式給藥,存在著服用量大、患者服用順應性差等局限,為開發具有良好降脂活性的中藥保健食品,本研究采用響應面法對復方降脂片的成型性工藝進行優化。結果表明,使用優選工藝所制備的片劑在外觀、硬度、崩解度、重量差異等均符合藥典規定,提示該工藝用于復方降脂片的制劑成型具有可行性[24-25]。

綜上所述,復方降脂片降脂活性良好,經優化所得到的成型性工藝操作簡單,采用普通片劑生產設備生產即可達到要求,適合工業化生產,為復方降脂片的生產提供理論基礎。且本研究對復方降脂片對高脂血癥大鼠的作用進行初步試驗研究,有助于明確復方降脂片對大鼠血脂的影響,并為相關的中藥開發和臨床應用提供一定的理論依據。