響應面法優化微波提取枇杷花槲皮素工藝及其對酒精分解關鍵酶活性的影響

徐 偉,馬智宇,李佳美,陳 華,范洪臣,張 光

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.南通市天籟村農業科技發展有限公司,江蘇海門 226100)

枇杷起源于中國,18世紀傳入歐洲,19世紀傳入北美洲,在我國主要分布在浙江、江蘇、福建、四川等長江以南各省[1-2]。枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)為薔薇科枇杷屬植物,枇杷花包括花及花蕾,花蕾被淺棕色或黃色絨毛,花味淡雅清香,花期長、花量大。枇杷樹的 80%～90%枝條都可形成花穗,并且單支花穗上花朵數為70～260左右,其中僅有 5%～20%的花可結成果實,約30%～50% 的花穗因疏花保果而被浪費[3]。根據《本草綱目》記載,枇杷的葉、花等均可以入藥[4],枇杷花富含類黃酮、類胡蘿卜素、三萜類、揮發油、礦物質元素等營養成分,姜帆等[5]篩選國內外代表性枇杷種質55份,采用分光光度法測定花中黃酮含量,發現不同枇杷種質之間黃酮含有量范圍在0.44%～2.28%之間,黃酮含量分布在0.98%～1.23%區間的種質較多。

黃酮類化合物有抗氧化以及對化學性肝損傷的輔助保護功能。天然黃酮類化合物主要分為:黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮等,槲皮素(Quercetin)是黃酮醇類化合物的一種,有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等生物活性[6-7],可有效防治肝損傷,主要體現在抗氧化應激、促進抗氧化酶合成等方面[8-9],研究表明槲皮素可通過恢復 frataxin 蛋白表達水平拮抗酒精性肝線粒體損傷[10],以及降低自由基水平和促炎物質的釋放水平等[11]。據研究可知,酒精進入人體后90%在肝臟內被代謝[12-15]。當血液中乙醇濃度不高時,乙醇在乙醇脫氫酶(ADH)催化下被氧化為乙醛;當乙醇濃度過高時,ADH代謝系統為乙醇的主要代謝途徑,同時借助于過氧化氫酶(CAT)系統等進行代謝形成乙醛[16];乙醛在乙醛脫氫酶(ALDH)的作用下代謝成乙酸,乙酸分解為水和CO2后排出體外[17],故乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、過氧化氫酶的活性對酒精分解起重要作用。

微波輔助提取法高效、環保[18],近年來在中草藥成分提取中被廣泛應用。基于單因素和響應面分析法,采用微波輔助優化枇杷花槲皮素提取工藝,并對其在體外酒精分解過程中關鍵酶的影響進行初步研究。目前市場上解酒護肝產品均以藥類為主,本課題利用廢棄的枇杷花資源研究開發解酒護肝輔助食品,有廣闊的市場空間,為枇杷花的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷花 江蘇省海門市天籟村古枇杷園;無水乙醇、乙醛 分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠;槲皮素 色譜純,阿拉丁試劑公司;溴化鉀 光譜純,青島青藥生物工程有限公司;HP20型大孔吸附樹脂 山東摩爾化工有限公司;乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ADH)、氧化型輔酶I(NAD+) 純度≥98%,美國Sigma公司;過氧化氫酶(CAT) 北京博奧拓達科技有限公司。

HX-MC-1實驗室微波合成儀 北京祥鵠科技發展有限公司;723N UV5100型紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;FT-IRC97951傅立葉變換紅外光譜儀 Sartorius公司;VERSA max酶標儀(配有SoftMax Pro標準化數據分析和儀器控制軟件) Molecular Devices公司;3590酶標板 美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波輔助提取枇杷花槲皮素工藝 枇杷花自然風干至恒重,粉碎過60目篩備用。精確稱取2 g枇杷花粉末于三口燒瓶中,將三口燒瓶及冷凝裝置安裝至微波合成儀中,加入適當濃度的乙醇溶液在一定微波功率下提取,靜置冷卻,真空抽濾得到含有槲皮素的枇杷花提取液。通過預實驗確定溶劑乙醇濃度為60%,設定溫度為固定值60 ℃。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料液比對槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)),在微波功率600 W,微波時間25 min條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究料液比對槲皮素提取量的影響。

1.2.2.2 微波時間對槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照微波時間(10、15、20、25、30 min),在料液比1∶10 (g/mL),微波功率600 W條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究微波時間對槲皮素提取量的影響。

1.2.2.3 微波功率對槲皮素提取量的影響 稱取2 g枇杷花粉末,按照微波功率(300、400、500、600、700 W),在料液比1∶10 (g/mL),微波時間25 min條件下提取,靜置冷卻,真空抽濾備用,研究微波功率對槲皮素提取量的影響。

1.2.3 響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上采用Box-Behnken組合設計,以枇杷花槲皮素提取量為響應值進行提取條件優化,見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiments

1.2.4 枇杷花槲皮素提取量的測定 精確稱取槲皮素標準品10 mg,使用60%乙醇定容至50 mL,得到濃度為0.2 mg/mL的槲皮素溶液,分別取2、3、4、5、6、7 mL至100 mL容量瓶中,60%乙醇定容。在波長374 nm處,使用紫外分光光度法測量槲皮素質量濃度(y)與吸光度(x)之間的關系,得到方程y=0.0161x+0.0006(R2=0.9994),槲皮素含量在4～14 μg/mL之間線性關系良好。

將微波提取得到的枇杷花槲皮素提取液,離心取1 mL清液以60%乙醇稀釋100倍,以乙醇作為空白對照組進行校正,于波長375 nm下測定吸光度,試驗測定3次,對所得結果取平均值。枇杷花槲皮素提取量計算公式如下:

式中:m為根據標準曲線計算得出的槲皮素質量濃度(mg/mL);V為提取液即溶劑的體積(mL);N為稀釋倍數;M為枇杷花粉取樣量(g)。

1.2.5 枇杷花槲皮素的分離純化及紅外光譜分析 將枇杷花槲皮素提取物經減壓濃縮至體積恒定,約為原體積的15%,使用60%乙醇溶液稀釋濃度至0.2 mg/mL,取50 mL為上樣溶液,調至 pH=8,稱取預處理過的HP-20型樹脂10 g,濕法裝柱,以上樣流速為2 mL/min過HP-20型樹脂進行富集純化,使用95%乙醇洗脫,洗脫流速為2 mL/min,收集洗脫液,旋轉蒸發至無醇味,進行真空冷凍干燥(真空度-0.8 MPa,溫度-80 ℃)后使用研缽研磨成粉末。使用KBr壓片法進行紅外光譜分析。

1.2.6 枇杷花槲皮素對體外解酒過程中關鍵酶的活性影響實驗

1.2.6.1 ADH激活率的測定 體外測定在瓦勒-霍赫法(Valle & Hoch)[19]基礎上稍作改動。在96孔板中分別依次加入75 μL pH為8.8的焦磷酸鈉緩沖溶液、50 μL的27 mmol/L氧化型輔酶I溶液(NAD+)、25 μL的12%體積比的乙醇溶液為底物溶液,兩個樣品組分別添加1.0 mg/mL枇杷花槲皮素溶液和槲皮素標準溶液10 μL。對照組用10 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用25 μL蒸餾水代替11.5%的乙醇溶液,10 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;其他條件相同。混合后密封于25 ℃水浴5 min。然后立即加入0.3 U/mL的ADH溶液5 μL并搖勻,于340 nm處每10 s記錄一次吸光度值,連續測定5 min。

ADH酶活的計算公式如下:

式中:E-ADH 酶活力(U/mL),A-吸光度每分鐘的增大值,V-反應液的總體積(mL),EW-加入的ADH酶液活性(U/mL),6.22-NADH在340 nm下的摩爾消光系數,Q-ADH的激活率(%),E0-空白組酶活力。

1.2.6.2 ALDH激活率的測定 在96孔板中分別依次加入30 μL的pH為8.0的磷酸鈉緩沖液、200 μL的氧化型輔酶I溶液(NAD+)、10 μL底物溶液;兩個樣品組分別添加1.0 mg/mL枇杷花槲皮素溶液和槲皮素標準溶液2 μL后加入2 μL ALDH酶溶液,25 ℃保溫5 min。對照組用2 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用10 μL蒸餾水代替底物溶液;2 μL蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;其他條件相同。混合后密封于25 ℃水浴5 min。然后立即加入0.3 U/mL的ALDH溶液2 μL,搖勻后于340 nm每10 s記錄一次吸光度值,連續測定5 min。計算方法同1.2.5.1。

1.2.6.3 CAT激活率的測定 具塞試管中分別依次加入0.4 mL的pH為7.4的鈉-鉀磷酸鹽緩沖液、2 mL的65 μmol/L的H2O2底物溶液,37 ℃溫育5 min,0.4 mL的CAT酶溶液[20],37 ℃準確溫育60 s后加入枇杷花槲皮素溶液和鉬酸銨溶液;其中標準品對照組使用槲皮素標準溶液代替枇杷花槲皮素溶液;空白組用蒸餾水代替枇杷花槲皮素溶液;空白二組用蒸餾水代替底物溶液,室溫10 min后測定405 nm下吸光度值。

CAT酶活的計算公式如下:

式中:E-CAT酶活力(U/mL),A-樣液吸光度每分鐘的增大值,A0-空白組吸光度每分鐘的增大值,A2-空白二組吸光度每分鐘的增大值,Q-CAT 的激活率(%),E0-空白組酶活力。

1.3 數據處理

采用Excel 2016和SPSS軟件進行單因素實驗數據處理,Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對枇杷花槲皮素提取量的影響 料液比對枇杷花槲皮素提取量的影響見圖1。由圖1可知,枇杷花槲皮素的提取量隨提取溶劑比例的增大而增大,當料液比為1∶10 (g/mL)時,枇杷花槲皮素的提取量到達了最高值6.831 mg/g,可能是由于此時提取溶劑與枇杷花細胞已經充分接觸[21],槲皮素浸出基本達到最大值;當溶劑的比例繼續增大時,枇杷花槲皮素的提取量降低,因此確定料液比為1∶10 (g/mL)。

圖1 料液比對枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of quercetin注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05);圖2～圖3同。

2.1.2 微波提取時間對枇杷花槲皮素提取量的影響 微波提取時間對枇杷花槲皮素提取量的影響見圖2。當提取時間在10～20 min范圍內,枇杷花槲皮素提取量逐漸增大,20～25 min時枇杷花槲皮素提取量增加幅度大,提取時間為25 min時枇杷花槲皮素提取量出現最大值;提取時間為25～30 min時枇杷花槲皮素提取量無明顯變化,可能是因為槲皮素經長時間的高溫浸泡,分子結構遭到破壞,雜質溶出,體系黏度增加[22]。因此,提取量近似時,在節省溶劑的前提下確定25 min為最佳提取時間。

圖2 微波提取時間對枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.2 Effect of time on the extraction yield of quercetin

2.1.3 微波功率對枇杷花槲皮素提取量的影響 微波功率對枇杷花槲皮素提取量的影響見圖3。隨著微波功率增加,槲皮素提取量逐漸增加,在微波功率600 W時,槲皮素提取量達到最高值,功率越高,萃取時溶劑擴散速度越快,溫度升高,對枇杷花細胞的破壞作用越大,有利于槲皮素溶出,功率與提取量呈線性正相關;隨著微波功率增加,提取量略有降低,這

圖3 微波功率對枇杷花槲皮素提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction yield of quercetin

可能是由于此時槲皮素分子的溶出基本達到最大值,溶出與擴散的速率和量已基本達到平衡[23]。從節能和提取效率等因素綜合考慮,選擇600 W為最佳提取功率。

2.2 響應面優化實驗結果與分析

響應面優化實驗設計及結果見表2,分析實驗結果得回歸方程為:Y=8.17-0.42A+0.39B+0.48C-0.22AB+0.16AC+0.45BC-1.27A2-0.12B2-0.62C2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experiments design and results

圖5 微波提取時間和功率對槲皮素提取量影響的響應面圖Fig.5 Plots for the effects of time and microwave power on the yield of quercetin

2.2.1 方差分析及顯著性檢驗 方差分析及顯著性檢驗結果見表 3。可以看出該模型回歸極顯著,失擬項不顯著,決定系數R2=0.9986,說明該模型能解釋99.86%的響應值變化,因而該模型擬合程度比較好,可以用此模型對槲皮素提取進行分析和預測,建模成功。各因素對枇杷花槲皮素提取量的影響從大到小依次為:C微波提取功率(W)>A微波提取時間(min)>B料液比(g/mL)。

表3 方差分析及顯著性檢驗結果Table 3 Analysis of variance and significance test of the regression model

2.2.2 因素交互作用分析 交互作用對槲皮素提取量的影響見圖4～圖6。固定微波功率,隨著微波提取時間和液固比的增大,槲皮素提取量有先增大后減小的趨勢。固定料液比,隨著微波提取時間和功率的增大,槲皮素提取量有先增大后減小的趨勢。固定提取時間,槲皮素提取量隨著功率和液固比的增大呈先升高再降低的趨勢;曲面坡度陡峭程度明顯。

圖4 微波提取時間和液固比對槲皮素提取量的影響Fig.4 Plots for the effects of time and liquid/solid ratio on the yield of quercetin

圖6 微波功率和液固比對槲皮素提取量影響的響應面圖Fig.6 Plots for the effects of microwave power and liquid/solid ratio on the yield of quercetin

響應面優化分析得到的最優條件為:微波提取時間23.49 min、微波提取功率603.93 W、液固比12.64 mL/g,在此條件下模型預測槲皮素提取量為8.29 mg/g;考慮到實際操作,以上條件優化為:微波提取時間25 min、微波提取功率600 W、料液比1∶15 g/mL;在此條件下進行三次平行實驗,平均提取量為8.26 mg/g,與預測值接近。

2.3 枇杷花槲皮素提取物的紅外光譜分析

經過HP-20型樹脂純化后的枇杷花槲皮素(純度為64.87%)經過真空冷凍干燥后制成粉末,使用KBr壓片法進行紅外光譜分析。

紅外光譜分析結果見圖7。1663 cm-1處出現C=O拉伸振動峰,1611 cm-1處出現苯環骨架C=C伸縮振動吸收峰,1382 cm-1處出現C-OH羥基面內彎曲振動峰,以上均為槲皮素分子官能團的主要吸收峰,可初步推測提取物中含有槲皮素單體[26]。

圖7 枇杷花槲皮素提取物的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of quercetin extract from loquat flower

此外,3336～3468 cm-1出現較寬較強的吸收峰,是羥基的伸縮振動峰,表明存在較大量的酚羥基或糖上的羥基;在2853 cm-1出現-CH2的伸縮振動,吸收峰的強度較小,說明飽和碳上的氫較少;1525 cm-1處有吸收峰,處于紅外光譜圖的第三、四峰區,表征為苯環的伸縮振動,說明芳環結構的存在;在1093 cm-1左右出現較強吸收峰,是C-O的伸縮振動峰;綜上,初步推測枇杷花槲皮素提取物中含有槲皮素等黃酮醇單體存在。

2.4 體外解酒酶活實驗結果分析

實驗結果見表4。實驗重復三次,結果取平均值。采取槲皮素標準品進行對照實驗,探究枇杷花槲皮素對酒精分解中關鍵酶的激活率。實驗結果表明,純化后的枇杷花槲皮素提取物對解酒過程中三種關鍵酶ADH、ALDH、CAT的活性均有一定提高，激活率分別為:24.83%、29.18%、22.36%。枇杷花槲皮素有助于酒精分解,其降低乙醇濃度的機制之一是通過提高ADH、ALDH、CAT的活性,加速乙醇和乙醛的分解;現有研究表明,葛花人參合煎液對ADH的激活率為21.3%,其中葛花中含有槲皮素及多種化合物[27];非水相中制備的玉米肽在體外試驗中對ADH 激活率為27.1%,ALDH 激活率為 50.0%[28];枇杷花槲皮素對ADH的激活率較低,這可能是由于枇杷花槲皮素成分較單一、含有一定雜質以及純度不夠高等原因造成的。

表4 枇杷花槲皮素對ADH、ALDH、CAT激活率的影響Table 4 Effects of quercetin from loquat flower on activation rates of ADH,ALDH and CAT

3 結論

通過單因素實驗考察料液比、微波時間、微波功率對枇杷花槲皮素提取量的影響,響應面試驗設計優化枇杷花槲皮素的最佳提取工藝,實驗擬合性好,得到最佳提取工藝條件為微波提取時間25 min、微波提取功率600 W、料液比1∶15 g/mL;在該條件下枇杷花槲皮素的提取量為8.26 mg/g。HP-20型大孔樹脂純化后的枇杷花槲皮素提取物對解酒過程中三種關鍵酶ADH、ALDH、CAT的活性均有一定提高;激活率分別為:24.83%、29.18%、22.36%。枇杷花槲皮素的微波輔助提取可為廢棄枇杷花資源化、高值化轉化提供一定技術參考,同時也為開發解酒護肝輔助食品提供有效的生物活性物質,若能進一步提高枇杷花槲皮素純度以及與其他產品進行復配等,該類產品將有廣闊的應用價值及市場空間。