楓槭葉酶解液美拉德反應及其揮發性成分分析

王宣靜,張天兵,蘇海洋,梁佳欣,陳治岍,周鵬飛,許春平,*

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南鄭州 450000; 2.江蘇中煙工業有限責任公司技術中心,江蘇南京 210019)

香精香料作為一種添加劑已經被廣泛應用到食品生產中,它可以彌補食品本身的缺陷,增加食品的香味,掩蓋食物的不良氣息。近年來,以天然植物的提取物為原料,利用微生物發酵技術[1]、生物酶解技術[2-3]、美拉德反應[4-5]等制備食用香精的研究被廣泛報道。徐達等[6]以白玄參為原料,采用復合酶對白玄參進行酶解提取,將酶解液進行濃縮后加入氨基酸進行美拉德反應制備煙用香料,并進行工藝優化,評吸結果表明,該美拉德反應產物可以有效掩蓋雜氣,減輕刺激性,中和苦味,增加津甜的口感。白家峰等[7]以煙草花蕾酶解液為原料,通過進行不同時間的美拉德反應得到各美拉德反應產物,并利用主成分分析和感官評吸的方法對不同美拉德反應時間的產物的揮發性香味成分進行探究,找到最佳的美拉德反應時間,為煙草花蕾制備煙用香料提供了新方法。鄭家倫等[8]以大豆粕為原料,通過酶解進而利用美拉德反應制備咸味香精,研究了酶的添加順序對酶解液性質的影響,通過測定大豆粕酶解液的水解度、還原糖含量、氨基氮含量等指標,確定酶的添加順序,提高了產物的感官質量。

楓槭浸膏是楓槭葉粉末經乙醇提取濃縮后得到的產物,多為深褐色膏體,具有焦香、甜香特征,在食品與卷煙工業中多有應用。蘇東贏[9]對楓槭浸膏不同溫度下的熱解產物進行了定性定量分析,并將其加入卷煙中發現突出了卷煙的焦甜香韻,改善了卷煙的抽吸品質。菜莉莉等[10]對市售的5種楓槭浸膏的揮發性成分進行HS-SPME-GC/MS分析,并采用單因素方差分析和主成分分析比較了其揮發性成分的差異。但現階段對以天然植物楓槭為原料結合美拉德反應制備食品香精的研究還很少。本文對楓槭葉粉末酶解后的酶解液進行不同溫度梯度(90、100、110 ℃)的美拉德反應,選用GC-MS聯用技術結合主成分分析對楓槭葉粉末酶解液的美拉德反應樣品的揮發性成分進行研究,以期充分發揮天然植物楓槭的可用性價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楓槭 廣東梅州2017年產;纖維素酶(50000 U/g)、果膠酶(100000 U/g)、半纖維素酶(200000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(6000 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;1,2-丙二醇、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、無水乙醇(AR) 天津市富宇化工有限公司;0. 8211 mg/mL乙酸苯乙酯(色譜純) 美國Sigma-Aldrich公司。

Q-100A3高速多功能粉碎機 上海冰都電器有限公司;DGX-9143電熱恒溫鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司;TGL-16 M離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;同時蒸餾萃取裝置 鄭州科技玻璃儀器廠;Agilent GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司;QYC-200搖床 上海福瑪實驗設備有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理 將干燥的楓槭葉粉碎過300目篩,置5～10 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 樣品酶解處理 根據相關酶解研究[11-13],將預處理后的楓槭葉粉末以料液比1∶10加150 mL水制成水提取物,取部分水提取物在預實驗確定的最優酶條件下:酶解溫度50 ℃,酶解體系pH為7,酶解加酶量為楓槭的質量的1.5%(四種酶分別為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶,加酶比例分別為1∶1∶1∶1),酶解5 h。

1.2.3 美拉德反應 以楓槭葉粉末酶解水提取物為原料進行美拉德反應，在150 mL酶解水提取物的樣品中加入濃度為30%的氫氧化鈉調節pH為7。將楓槭葉粉末酶解液于90、100、110 ℃的油浴鍋中進行美拉德反應3 h,其反應產物分別記為A1、S1、B1;將楓槭葉粉末水提取物放置于100 ℃的油浴鍋中進行美拉德反應3 h,其反應產物記為S2。

1.2.4 蒸餾萃取提取香味物質 在同時蒸餾萃取裝置的平底燒瓶中加入各個美拉德反應樣品150 mL,再加入100 mL蒸餾水,搖勻,調節電子調溫電熱套溫度,使得平底燒瓶中物質處于微沸狀態,在裝置的另一端蒸餾瓶中加50 mL二氯甲烷,在60 ℃水浴鍋中加熱。觀察加熱過程,當二氯甲烷與水出現分層時開始計時2.5 h后萃取結束,待冷卻后,在二氯甲烷萃取液中加入10 g無水硫酸鈉和1 mL濃度為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(內標物),靜置過夜。然后在35～40 ℃的水浴鍋中進行濃縮。濃縮樣品至約1 mL轉至1.5 mL樣品瓶中,在2～4 ℃下密封保存,待用于GC/MS進行定量分析[14-17]。利用Nist 11譜庫將質譜圖中各色譜峰進行檢索,同時進行人工解析,對化學成分進行定性分析(匹配度>80%)。采用內標法對物質進行定量。揮發性物質含量(μg/g)=[內標物質量(μg)×揮發性物質峰面積]/[內標物峰面積×樣品質量(g)][18]

1.2.5 GC-MS條件 色譜條件:色譜柱為HP-5MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣:氦氣;載氣流量為:3 mL/min;進樣口溫度:280 ℃;分流比10∶1;進樣量 1 μL;升溫程序為:初起始溫度50 ℃,以4 ℃/min升至280 ℃;質譜條件:EI源;接口溫度270 ℃,電子能量:70 eV,四極桿溫度:150 ℃;采集模式:掃描;質量掃描范圍:35～550 amu。

1.2.6 主成分分析方法 使用SPSS軟件進行主成分分析(PCA),計算相關系數矩陣,主成分特征值和累積貢獻率。根據進行了不同時間的美拉德反應的楓槭酶解液中相關成分的含量標準化值與特征根、特征向量,計算出各主成分值,并以此作出散點圖。

2 結果與分析

2.1 二種不同處理方式的樣品香味成分的GC/MS結果分析

根據S1與S2的GC/MS分析結果作圖1和圖2,觀察圖1可知,S1與S2相比,揮發性成分醇類、烯類、酮類、酯類、醛類、酚類、雜環類的種類數都有所增加;觀察圖2可知S1的揮發性成分總量為178.70 μg/g,S2的揮發性成分總量為87.40 μg/g,S1與S2相比,美拉德反應后樣品的揮發性成分含量增加了91.30 μg/g。由此得出,楓槭葉酶解后進行美拉德反應,產物中包含了更多的揮發性成分,使產物風味更為獨特。

圖1 S1和S2楓槭樣品揮發性成分種類數Fig.1 Species of volatile components of maple samples S1 and S2

圖2 S1和S2楓槭樣品的揮發性成分含量Fig.2 Histogram of volatile components of maple samples S1 and S2

2.2 不同溫度的美拉德反應樣品GC-MS數據的分析

楓槭葉酶解液90 ℃條件下的美拉德反應樣品A1、100 ℃條件下美拉德反應物樣品S1、110 ℃條件下美拉德反應物樣品B1的揮發性成分經GC-MS檢測結果見表1。

表1 楓槭葉酶解液不同溫度的美拉德反應樣品揮發性物質含量(μg/g)Table 1 Content of volatile matter in Maillard reaction samples of maple leaf enzymatic hydrolysate at different temperatures(μg/g)

對楓槭葉粉末酶解液在不同溫度下美拉德反應樣品的揮發性成分進行GC-MS分析。從GC-MS的分析結果(表1)可以看出,已鑒定出揮發性成分主要包括酸類、醇類、萜烯類、酮類、酯類、酚類、醛類、雜環類和其他類。A1、S1、B1中已鑒定出的揮發性物質種類分別有67種、55種、50種,其中反應溫度為90 ℃(A1)中揮發性成分種類最多;揮發性成分總量從多到少所對應的樣品依次為A1、S1、B1,揮發性成分總量分別為235.9、178.7、174.7 μg/g,其中反應溫度為90 ℃(A1),鑒定出的揮發性成分含量最多。

續表

續表

楓槭葉粉末酶解液進行美拉德反應后,樣品的揮發性成分中酸類化合物在A1中含量最高,為47.6 μg/g,其中肉豆蔻酸含量最高,為17.4 μg/g,肉豆蔻酸是具有花香、甜香等香味特征的化合物[19];醇類化合物的含量在A1、S1、B1中相差不大;萜烯類化合物、酮類化合物在A1中含量最高,其中1-石竹烯在S1萜烯類化合物中含量最高,為16.7 μg/g,4-甲基-1-(1-甲基乙基)-雙環[3.1.0]己-3-烯-2-酮在A1酮類化合物中含量最高,為12.1 μg/g,這些物質本身都帶有獨特的香味,對整體風味起到一定修飾作用;酯類化合物含量S1略高于A1,其中二氫獼猴桃內酯在A1酯類化合物中含量最高,為8.1 μg/g,二氫獼猴桃內酯具有典型的木香、茶香和桃子香氣的特征[20],對香氣有較好的影響。

2.3 楓槭酶解液不同溫度美拉德反應特征致香成分分析

美拉德反應又稱為羰氨反應,是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸)間的反應,其產物能賦予食品愉快的香味。表1雜環類中1-丁基-1H-吡咯、2-戊基呋喃、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪為美拉德反應的特征致香成分[21]。

美拉德反應特征致香成分總量在A1中含量最高為25.0 μg/g,其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高為23.5 μg/g,吡嗪類物質的形成是氨基親核進攻羰基并發生加成和脫水反應的結果[22],一般具有堅果、燒烤等風味特征[23],能夠增加食品的甜香和焦香香韻;2-戊基呋喃、1-丁基-1H-吡咯在A1中含均為0.6 μg/g,2-戊基呋喃是具有豆香、果香、清香的化合物[24-25],1-丁基-1H-吡咯是具有烘烤香韻的化合物,這些化合物整體閾值較低,對楓槭美拉德特征香味的形成有著重要的影響。A1中雜環類占比(10.60%)相對于酸類(20.18%)、醇類(22.26%)、烯類(20.26%)、酮類(15.35%)較低,可能是因為所設置的美拉德反應的時間較短,還未形成足夠的特征性風味物質。

2.4 主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 21軟件因子分析模塊中的降維分析[26],用主成分分析分析不同溫度美拉德反應后的楓槭酶解液中86種揮發性成分,得到主成分載荷矩陣表(見表2)、特征值和貢獻率(見表3)。

表2 主成分載荷矩陣Table 2 Principal component load matrix

表3 2種主成分的特征值和貢獻率Table 3 Characteristic values and contribution rates of 2 main components

由主成分載荷矩陣表(表2)可以得出,在主成分1中,載荷值較高的正影響揮發性成分有3,4-二甲基-3-環己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚,載荷值依次是0.999、0.996、0.996、0.987、0.983,主要指向醛、酮類物質;負影響最大的為反油酸,載荷值為-0.999。在主成分2中,載荷值較高的正影響揮發性成分有左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮等物質載荷較高,載荷值依次是0.997、0.996、0.986、0.980、0.962,主要指向烯、醇類物質;負影響最大的為3-甲基-6-(1-甲基亞乙基)-環己烯,載荷值為-0.994。主成分載荷矩陣顯示了各變量與各主成分之間的關系,數值的絕對值越大,表明該指標與某一主成分的聯系緊密程度越大,反映了該指標在該主成分上的載荷程度;載荷值小的揮發性成分對楓槭的揮發性風味貢獻小,同時也表明它的含量極低或未檢出。

由表3可知,主成分1、2的累積貢獻率達到100%,則說明這86種揮發性成分可以分別用主成分1、主成分2進行主成分分析。綜合表2可認為3,4-二甲基-3-環己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮為楓槭揮發性成分的主要特征化合物。

根據表1中三個進行不同美拉德溫度處理的樣品中86種香氣成分的相對含量、表3中2種主成分的特征值和表2中86種香氣成分的載荷值計算出三個樣品中的第一、第二主成分值,然后以第一主成分為X標,第二主成分為Y坐標,做主成分分散圖(圖3)、散點圖(圖4)。圖4中的86種香氣成分對應于表1中的香氣成分。

圖3 美拉德處理溫度不同的三個樣品的主成分分散圖Fig.3 Principal component dispersion diagram of three samples with different Maillard treatment temperature注:1為美拉德反應90 ℃的樣品,2為美拉德反應 100 ℃的樣品,3為美拉德反應110 ℃的樣品。

圖4 不同美拉德處理溫度的86種香氣成分散點圖Fig.4 Scatter diagram of 86 aroma components with different Maillard treatment temperature

由圖3可知,3個樣品根據距離遠近可分為3個區域,美拉德反應90、100、110 ℃的樣品彼此距離較遠,表明3個樣品的主成分差異均較大。通過觀察圖4可知,美拉德反應90 ℃的香氣主成分集中在第二象限,對其特征香氣影響較大的香味物質主要包括正十五酸、十四烷酸、葉綠醇等;美拉德反應100 ℃的香氣成分主成分集中第一象限,對其特征香氣影響較大的香味物質主要包括(+)-香橙烯、亞油酸乙酯、4,6,6-三甲基二環[3.1.1]庚-3-烯-2-酮等香味物質;美拉德反應110 ℃的香氣成分主成分集中在第四象限,對其特征香氣影響較大的香味物質主要包括棕櫚酸甲酯、左旋-alpha-蒎烯、環乙烯甲醛等香味物質。

GC-MS數據結果表明,90 ℃時揮發性物質的含量和種類最多,主成分分析同樣發現90 ℃美拉德反應樣品揮發性物質分布最多,多為酸類、醇類、酮類物質,酸類物質本身帶有獨特的香氣;飽和醇風味閾值較高,香味不明顯,不飽和醇閾值較低,具有蘑菇香氣;酮類物質具有一定的果香味,有研究表明一些酮類物質在低閾值時與醛類或其他物質存在相互作用,產生氣味增強或改變現象[27]。結合上述結果可認為美拉德反應溫度為90 ℃時得到的樣品具有最佳的風味和感官品質。

3 結論

本文分別以楓槭葉水提取物、楓槭葉酶解液為原料進行美拉德反應,與楓槭葉水提取物的美拉德反應樣品相比,楓槭酶解液美拉德反應樣品的揮發性成分種類和含量都有所增加。楓槭葉酶解液經不同溫度的美拉德反應后香味成分的種類和含量變化較大,美拉德反應90 ℃的樣品揮發性香味成分的種類最多為67種,主要包括酸類、醇類、萜烯類、酮類、酯類、酚類、醛類、雜環類和其他類。其中美拉德反應90 ℃時樣品揮發性物質總量含量最高,達235.9 μg/g。通過主成分分析可知美拉德反應90、100、110 ℃的樣品彼此距離較遠,表明其主成分差異均較大,90 ℃美拉德反應揮發性物質分布最多,且認為3,4-二甲基-3-環己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮為楓槭揮發性成分的主要特征化合物。結合上述結果可認為在美拉德反應溫度為90 ℃時得到的樣品具有最佳的風味和感官品質。