超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉和豬肉中利尿劑殘留量

薛 穎,花 錦,高 浩,杜利君,徐 瑤,黃立亭,王嘉妮

(1.太原海關技術中心,山西太原 030024; 2.陜西省產品質量監督檢驗研究院農副食品所,陜西西安 710048)

利尿劑是指一類用于治療高血壓及水腫的藥物,如呋塞米、托拉塞米、布美他尼等,能增加鈉鹽和水分的排出量進而增加尿量[1]。但是利尿劑如果被長期或者過量使用,可能會引起血量下降,甚至低血壓、休克、腎衰竭、猝死等副作用[2]。目前,利尿劑會被當成獸藥添加到飼料,用于治療牛乳房炎,或者改善禽蛋蛋白比例等[3]。但一些不法分子會用利尿劑來掩蓋其他違禁藥物的使用,比如比賽時運動員攝入興奮劑等違禁藥物,通過利尿劑,以達到違禁藥物在尿液中濃度降低并盡快排出體外的目的,從而通過藥檢等。因此,1988年國際奧委會將利尿劑列為禁用物質的興奮劑類。目前被列在國際奧委會禁用物質表內的利尿劑主要有15種,分為以下四類:髓襻利尿劑、噻嗪類利尿劑及相關化合物、保鉀利尿劑、碳酸酐酶抑制劑。呋塞米、螺內酯、布美他尼是山西省于2019年舉辦第二屆全國青年運動會所檢測的3種利尿劑。呋塞米、布美他尼屬于髓襻利尿劑,螺內酯屬于保鉀利尿劑,均屬于禁用物質。

目前,關于利尿劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-8]、液相色譜串聯質譜法[11-24]等。楊旺火[2]采用了高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中利尿劑的含量。王培龍等[3]采用氣相色譜-質譜法作為確證方法確證飼料中利尿劑的含量。唐坤等[6-7]采用了高效液相色譜-熒光法測定人血漿和藥品中布美他尼片的含量。謝敏等[8-9]研究了減肥功能食品中非法添加物的檢測方法。歐貝麗等[10-13]研究了功能性食品中利尿劑和非法添加物的液相色譜串聯質譜檢測方法。王旭峰等[14-16]建立了尿液中利尿劑等物質的液相色譜-質譜檢測方法。許文佳等[17-23]研究了采用超高效液相色譜串聯質譜法檢測化妝品中利尿劑等物質的含量。梁楊等[24]建立了人血漿中6種常用利尿劑的液相色譜-質譜法,提出了基于QuEChERS的新方法。

液相色譜法檢測靈敏度較低,檢測利尿劑時一般是作為初篩,且該方法基質復雜易被干擾;液相色譜串聯質譜法雖然前處理較為復雜,但靈敏度高,且可以選擇離子,因此具有不易被干擾的特點。因此,液相色譜串聯質譜法一般是作為利尿劑檢測的確證方法。目前,國內在動物源性食品中檢測的文獻暫無報道,而且也尚無任何檢測的相關標準,不利于執法部門對動物源性食品的監管。本實驗采用超高效液相色譜串聯質譜對雞肉和豬肉中呋塞米、螺內酯、布美他尼3種利尿劑藥物的檢測進行研究,為監管部門對動物源性食品的監測提供執法依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

呋塞米標準品 德國Dr.Ehrensorfer公司,質量分數98.7%;螺內酯標準品 北京曼哈格生物科技有限公司,質量分數99.9%;布美他尼標準品 中國食品藥品檢定研究院,質量分數99.9%;甲醇、乙酸乙酯、乙腈 色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司;甲酸 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;C18粉 ODS,50 μm粒徑范圍,60 ?平均孔徑,廣州碩譜生物科技有限公司;豬肉、雞肉 市售。

QTRAP 4500型全自動固相萃取超高效液相色譜質譜聯用儀 美國AB SCIEX公司;XP404S型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團;EOFO-945616型食品攪拌機 美國TALLBOYS公司;DTA-27型超聲波清洗器 湖北鼎泰恒勝科技設備有限公司;Milli-Q型超純水系統 美國Millipore公司;HC-3518型離心機 科大創新股份有限公司;N-EVAP型氮吹儀 美國ORGANOMATION ASSOCINTES INC公司;GM 200型刀式混合研磨儀 弗爾德(上海)儀器設備有限公司;0.22 μm尼龍濾膜 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備溶液:分別稱取螺內酯、呋塞米、布美他尼標準品0.010 g于10 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解,超聲30 min后定容到10 mL,得到1000 mg/L標準儲備溶液。

中間標準溶液:精密量取螺內酯、呋塞米、布美他尼標準儲備液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,用甲醇配制成10 mg/L中間標準溶液。

標準工作溶液:稱取5個雞肉樣品和5個豬肉樣品,經1.2.2得到的5個雞肉空白基質的5個豬肉空白基質。用空白基質分別配制成濃度為1、10、30、250、500 μg/L的雞肉標準工作溶液和豬肉標準工作溶液,臨用現配。

1.2.2 樣品處理 本試驗參考梁楊[24]對血漿中利尿劑的提取方法和凈化方法。在此基礎上,本試驗還考慮了基質效應,采用基質配標消除基質的影響。

將市售雞肉和豬肉在-20 ℃的冰箱內密封保存。取適量新鮮或者冷凍解凍的樣品,去筋、搗碎均勻。準確稱取2 g樣品(精確至0.01 g),置于50 mL聚乙烯離心管中,加入10 mL乙酸乙酯溶液,渦旋1 min,超聲提取10 min,超聲頻率為32 kHz,4000 r/min離心10 min,吸取上清液于15 mL離心管中,氮吹吹至近干,加入100 mg C18粉末,用1 mL甲醇∶水(1∶1)溶液溶解,渦旋1 min,過0.22 μm尼龍濾膜,供超高效液相色譜串聯質譜聯用儀分析測定。

1.2.3 檢測條件 液相色譜條件:色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(1.9 μm,2.1 mm×50 mm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;流速為0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量為10 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相比例Table 1 The proportion of mobile phase

質譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正負離子同時掃描;監測方式:多反應監測模式(MRM);氣簾氣(Curtain Gas):30 psi;噴霧氣(Gas1):50 psi;輔助霧化氣(Gas2):60 psi;離子源溫度:600 ℃;電離電壓:5500 V/-4500 V;碰撞氣:氮氣。其它質譜參數見表2。

表2 3種化合物的質譜條件Table 2 MS/MS parameters for three compounds

1.3 數據處理

本試驗所得圖譜均由數據處理軟件MultiQuant 3.0.2處理所得。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別用甲醇∶水(1∶1)溶液配制濃度均為0.5 μg·mL-1的螺內酯、呋塞米、布美他尼標準溶液。將這3種利尿劑的標準溶液分別注入ESI離子源,針泵速度設置為10 μL/min。通過對3種利尿劑的進行一級質譜全掃描,發現螺內酯在正離子模式得到的信號高且穩定;呋塞米在正離子模式下,未找到明顯的正離子峰,而在負離子模式下得到的信號高且穩定;布美他尼正負離子均可檢測到,但在負離子模式下,低豐度離子碎片干擾更少。因此,本試驗采用正離子模式掃描螺內酯,負離子模式掃描呋塞米和布美他尼。

呋塞米的分子量為330.74,在高溫源內易脫去氫。故條件優化時,理論上將母離子m/z設置為329.7。圖1為呋塞米的一級質譜掃描圖。如圖1所示,母離子的峰強度達到107,根據試驗結果,將母離子的m/z確定為328.9。圖2為呋塞米碎片離子質譜掃描圖。如圖2所示,應選擇峰強度最高的m/z為284.8和204.9作為呋塞米的特征子離子。與伍麗萍等[12]研究結果一致。

布美他尼的分子量為364.42,它在高溫源內易脫去氫,結合試驗結果,將母離子m/z設置為363.0。圖3是布美他尼的一級質譜掃描圖,由圖3可見該化合物的母離子強度達到109以上。圖4為布美他尼的碎片離子質譜掃描圖。由圖4可知,應選擇峰強度達到105的m/z為319.1和206.9作為布美他尼的特征子離子。與伍麗萍等[12]研究結果一致。

圖3 布美他尼一級質譜掃描圖Fig.3 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Bumetanide

圖4 布美他尼碎片離子質譜掃描圖Fig.4 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Bumetanide

楊旺火[2]研究發現,雖然螺內酯的分子量為416.57,但它在高溫源內易脫去乙酰基巰基,得到341.2的正離子峰。該峰其信號穩定,可作為螺內酯的一級質譜信號,且二級特征離子信號重現性好,可滿足監測要求,因此,本試驗條件優化時將m/z為341.2作為母離子。圖5為螺內酯的一級質譜描圖。如圖5所示,m/z為341.2的峰強度達到107以上。圖6為螺內酯的碎片離子質譜掃描圖。如圖6所示,選擇二級碎片離子中強度最高的m/z為107.0和187.0,可將其作為螺內酯的特征子離子。與楊旺火[2]對于螺內酯子離子的選擇一致。

圖5 螺內酯一級質譜掃描圖Fig.5 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Spironolactone

圖6 螺內酯碎片離子質譜掃描圖Fig.6 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Spironolactone

得到3種化合物的子離子后,分別進行去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)的優化。優化后的質譜參數見表2。

2.2 色譜條件的優化

色譜常用的作為流動相的有機試劑是乙腈和甲醇,而水相一般為甲酸水或乙酸銨。因此,考察了不同水相和有機相對目標化合物的影響。本試驗用流動相初始比例配制1 μg/L的三種利尿劑混標,在對應流動相條件下在超高效液相色譜串聯質譜儀器上進行檢測。試驗結果見表3。

表3 3種利尿劑在不同流動相條件下的峰面積Table 3 Peak area of three diuretics in different mobile phase

試驗表明,用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相時,三種化合物的峰面積都是最大。因此,本試驗的流動相確定為乙腈和0.1%甲酸水溶液。

2.3 提取溶劑的選擇

螺內酯、呋塞米、布美他尼均不溶于水,因此選用提取試劑時選擇用有機試劑來進行提取,一般選用的提取試劑有甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯。試驗考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液對三種利尿劑的回收率影響,試驗結果如表4所示。

表4 不同溶劑提取得到的利尿劑的回收率(%)Table 4 Recovery of diuretics extracted by different solvent(%)

由表4可知,乙酸乙酯溶液對化合物提取回收率是最好的,二氯甲烷的是最差的。因此,確定乙酸乙酯為提取溶劑,與梁楊關于血漿中利尿劑的提取效果一致[24]。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

按照2.1、2.2和2.3所優化的條件進行試驗,用空白雞肉基質配制濃度均為1.0 μg/L的標準混合溶液,上機分析,得到3種利尿劑標準溶液的色譜圖,見圖7～圖12。

圖7 螺內酯的選擇離子流圖(341.2/187.0)Fig.7 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/187.0)

圖8 螺內酯的選擇離子流圖(341.2/107.0)Fig.8 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/107.0)

圖9 呋塞米的選擇離子流圖(328.9/204.9)Fig.9 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/204.9)

圖10 呋塞米的選擇離子流圖(328.9/284.8)Fig.10 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/284.8)

圖7～圖12表明,本試驗3中利尿劑的標準品的峰形很好,且無干擾,信噪比也均滿足(S/N)≥10的要求。

圖12 布美他尼的選擇離子流圖(363.0/319.1)Fig.12 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/319.1)

本試驗考慮到基質效應,選擇用雞肉和豬肉的空白樣品稀釋中間標準液,配制1.0～500.0 μg/L的系列標準溶液進行測定,以各個化合物的峰面積的平均值為縱坐標y,質量濃度為橫坐標x,繪制標準曲線,其相關系數均大于0.996。以信噪比(S/N)≥3為標準,確定方法的檢出限(LOD),以信噪比(S/N)≥10為標準,確定方法的定量限(LOQ),結果見表5。

圖11 布美他尼的選擇離子流圖(363.0/206.9)Fig.11 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/206.9)

表5 3種化合物的線性范圍、檢出限和定量限Table 5 Linear range,limits of detection and limits of quantification of three compounds

由表5可知,螺內酯、呋塞米、布美他尼標準溶液在濃度1.0～500.0 μg/L范圍內線性良好。3種化合物的線性方程及相關系數見表6。

表6 3種化合物的回歸方程和相關系數Table 6 Regression equation and correlation coefficient of three compounds

2.5 回收率和精密度

在空白豬肉和雞肉樣品中添加這3種利尿劑定量限的1倍、2倍、10倍,每個濃度進行6個平行,按照1.2進行檢測。結果表明3種利尿劑在豬肉中的回收率為67.3%～109.8%之間,RSD在1.7～5.8之間;在雞肉中的回收率為77.7%～111.6%,RSD在1.2～5.6之間,具體見表7、表8。

表7 豬肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 7 Average recoveries and precisions of swine(n=6)

表8 雞肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 8 Average recoveries and precisions of chicken(n=6)

3 結論

本文建立了同時檢測雞肉和豬肉中螺內酯、呋塞米、布美他尼的超高效液相色譜-串聯質譜法。通過優化液相和質譜的相關檢測參數,使得3種化合物的檢出限均達到0.5 μg/kg,定量限均達到1.0 μg/kg。本方法前處理過程較為簡單,采用了多反應監測模式(MRM),正負離子可同時采集。本方法靈敏度高,排除了干擾物;重現性好,六次平行的偏差滿足相關要求;準確度高,試驗的回收率滿足《GB/T 27404-2008實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的相關要求。因此,該方法能夠對這3種化合物同時進行準確的定性、定量分析。目前,國內尚未有雞肉和豬肉中利尿劑的檢測標準及相關文獻。本文的研究擴大了利尿劑的檢測范圍,為監管部門對雞肉和豬肉的監管提供了一定的技術支持。但本方法適用范圍只有雞肉和豬肉,還需進一步分析其他動物源性食品中利尿劑的檢測方法,為利尿劑檢測提供更多的技術支撐。