菊苣多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

吳雨龍,朱 華,張藝鏻,江海濤,華 春

(1.南京曉莊學院食品科學學院,江蘇南京 211171; 2.江蘇省高校“特殊生物質廢棄物資源化利用”重點建設實驗室,江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學院,江蘇南京 210013)

免疫是指機體免疫系統通過免疫應答識別自身和外來物質,消除抗原性異物,以維持機體在生理平衡下的功能[1]。免疫應答調節在預防疾病中起著重要的作用,活性物質誘導的免疫調節和免疫刺激的研究越來越受到重視。近期研究表明,免疫調節劑可以增強機體的防御反應,這是提高抗病能力的有效途徑[2]。臨床研究表明,增強機體免疫力可以有效地防御病毒、病菌的入侵[3]。因此,有效調節免疫活性已成為研究的熱點。

多糖是一種生物大分子,與蛋白質和核酸一樣是機體的重要組成部分。研究表明多糖具有多種生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、免疫調節以及抗炎活性等[4-6]。大多數活性多糖具有免疫功能,有關多糖的免疫機制已被越來越多的研究者關注[7-9]。作為非特異性免疫和特異性免疫系統的一部分,巨噬細胞和淋巴細胞在機體防御中起著關鍵作用。據報道,多糖可激活巨噬細胞和淋巴細胞的增殖[10]。

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科菊苣屬多年生藥食兩用草本植物,富含多糖、菊苣酸、多酚類等多種功能活性成分[11-12],其中菊苣多糖(chicory polysaccharide,CP)具有多種生物活性,如保護皮膚、抗氧化、抗疲勞、降脂保肝、延緩衰老等[13-17],但有關菊苣多糖提高免疫活性的研究尚未見報道。本研究利用免疫抑制小鼠模型評價菊苣多糖對免疫活性的調節作用,以期為進一步研究和綜合開發利用菊苣資源提供一定的科學依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣多糖(白色粉末,相對分子量為8511.4 Da;主要由山梨醇、葡萄糖、果糖和糖醇組成,摩爾比為1.00∶5.58∶13.97∶10.32;屬雜多糖,含有α-糖苷鍵) 南京曉莊學院食品科學學院生物功能分子研究室[15];ICR雄性小鼠 動物合格證號:SCXK(蘇)2017-0001,體質量18～22 g,南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供;脾氨肽口服液 北京第一生物化學藥業有限公司;環磷酰胺 上海寶生物科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 美國Sigma公司;雞紅細胞和綿羊紅細胞(SRBC) 北京博爾西科技有限公司;都氏試劑 北京中諾泰安科技有限公司;TNF-α酶聯免疫試劑盒(RAB0477-1KT)、IL-2酶聯免疫試劑盒(RAB0287-1KT)、IL-6酶聯免疫試劑盒(RAB0309-1KT) 德國Merck公司;其它試劑 均為國產分析純。

JA3003N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;YT-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化公司;XS-500i全自動血細胞分析儀 希森美康醫用電子(上海)有限公司;Forma TM 310細胞培養箱 美國Thermo公司;NIKON 50iH600L生物顯微鏡 日本尼康公司;SYNERGY/HTC全波段酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 雄性ICR小鼠240只,適應性飼養3 d后進行隨機分為6組(空白組、模型組、藥物組(脾氨肽)、菊苣多糖(chicory polysaccharide,CP)低、中、高劑量組。空白組灌胃等體積(10 mL/kg)純凈水;模型組灌胃等體積純凈水;藥物組灌胃脾氨肽口服液(一種較為常見的免疫刺激性藥物)83 mg/kg;CP低劑量組灌胃CP 100 mg/kg;CP中劑量灌胃CP 200 mg/kg;CP高劑量組灌胃CP 300 mg/kg;持續35 d。除空白組外,其余各組小鼠從第28～30 d腹腔注射環磷酰胺(60 mg/kg/d)以建立免疫抑制模型。最后一次灌胃給藥24 h后,各組小鼠隨機取10只稱重、采血、處死,取胸腺、脾臟等器官,備用。

1.2.2 免疫抑制小鼠凈體質量增率及免疫器官指數測定 根據之前記錄的小鼠的體質量、胸腺、脾臟計算小鼠的凈體質量增率和免疫器官指數。計算公式如下:

凈體質量增率(%)=(最終體質量-初始體質量)/初始體質量×100

式(1)

胸腺指數(%)=胸腺質量(g)/體重(g)×100

式(2)

脾臟指數(%)=脾臟質量(g)/體重(g)×100

式(3)

1.2.3 免疫抑制小鼠全血紅細胞和白細胞指標的測定 在小鼠采血完成4 h內,利用全自動血細胞分析儀對小鼠全血中的白細胞和紅細胞含量進行檢測。

1.2.4 免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-6以及TNF-α水平的測定 將1.2.1中所采各組小鼠血,置于2 mL離心管中,3000 r/min離心10 min,得小鼠血清樣品,分別用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-6以及TNF-α的水平。

1.2.5 免疫抑制小鼠遲發型變態反應檢測 經35 d處理后,根據Shimamura等[18]的方法,采用足跖增厚法測定遲發性變態反應。先用2%(v/v)SRBC進行腹腔免疫,每只小鼠注射0.2 mL,使其為致敏小鼠。免疫4 d后,用游標卡尺測量各組小鼠的左后足跖部的厚度,然后在測量部位皮下注射20%(v/v)的SRBC,每只小鼠注射20 μL,注射后24 h內同一時間測量左后足跖的厚度3次,取平均值。

1.2.6 小鼠血清溶血素的檢測 經35 d處理后,根據Zou等[19]的方法檢測血清溶血素。各組小鼠腹腔注射2%的SRBC懸液0.2 mL。免疫4 d后,進行眼眶取血,分離血清,用無菌的純凈水進行稀釋(1∶100)。在5 mL離心管中,按順序加入1 mL稀釋血清溶液,體積分數為10% SRBC 0.5 mL以及1 mL新鮮豚鼠血清混合均勻;空白組血清用純凈水代替。樣品在37 ℃恒溫水浴中孵育30 min,然后在0 ℃冰浴中停止反應。3000 r/min離心10 min,得上清液。取1 mL上清與3 mL都氏試劑充分混合均勻,同時,取0.25 mL 10% SRBC懸液加都氏試劑至4 mL充分混合均勻,將其作為半數溶血管。靜置10 min后,將空白組設置為參照,540 nm波長處測定各個樣品管的光密度值(OD),用半數最大溶血素抗體濃度(half-maximal hemolysin antibody concentration,HC50)表示各組小鼠血清溶血素的含量。計算公式如下:

HC50=(樣品管OD/半數溶血管OD)×稀釋倍數

式(4)

1.2.7 免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能測定 根據小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的方法來檢測腹腔巨噬細胞的吞噬能力[20]。取1.2.1各組中剩下的10只小鼠,腹腔注射6%淀粉肉湯(含臺盼藍)1 mL,連續注射3 d后,每只小鼠再注射1%雞紅細胞懸液1 mL,輕按小鼠腹部,使懸液分散。30 min后,頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠置于超凈工作臺內,75%乙醇腹部消毒,剖開腹腔,用吸管吸取腹腔液,滴1滴于干凈載玻片上,用細胞培養箱37 ℃孵育30 min,鏡檢,每片計數100個巨噬細胞,觀察記錄吞噬雞紅細胞的巨噬細數及被吞噬的雞紅細胞數。吞噬百分率和吞噬指數計算公式如下:

吞噬百分率(%)=(吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/巨噬細胞總數)×100

式(5)

吞噬指數=巨噬細胞吞噬的雞紅細胞總數/吞噬雞紅細胞的巨噬細胞總數

式(6)

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 CP對免疫抑制小鼠凈體質量增率及免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟是機體的主要免疫器官,胸腺指數和脾臟指數反映了機體的非特異性免疫情況[21]。因此,藥物對胸腺指數和脾臟指數的影響可作為研究動物模型免疫藥理學機制的初步指標[22]。環磷酰胺能夠抑制淋巴細胞的分化,減少免疫器官中淋巴細胞的數量,導致脾臟、胸腺和身體重量的減少[1]。由圖1A可知,與空白組相比,模型組小鼠的凈體質量增率極顯著下降(P<0.01);而經CP處理后,低、中、高三個劑量組小鼠凈體質量增率與模型組相比均上升,且呈一定的劑量依賴性。由圖1B可知，與模型組相比，CP中、高劑量組和藥物組顯著提高了脾臟指數(P<0.05)，而CP低劑量組差異不明顯。由圖1C可知，與模型組相比，CP高劑量處理組和藥物組顯著提高了胸腺指數(P<0.05)，而CP低、中劑量組雖然提高了胸腺指數，但不存在顯著差異。 結果表明，CP高劑量組能夠改善環磷酰胺引起的小鼠免疫器官的萎縮，對免疫器官有明顯的免疫增強作用。

圖1 CP對免疫抑制小鼠凈體質量增率、脾臟指數和胸腺指數的作用Fig.1 Effect of CP on net mass increase,spleen index and thymus index in immunosuppressed mice注:與模型組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);ns表示與模型組相比差異不顯著; 與空白組相比,#表示差異顯著(P<0.05);##表示差異極顯著(P<0.05)。圖2～圖6同。

2.2 CP對免疫抑制小鼠全血紅細胞和白細胞指標的影響

機體血液中的紅細胞具有識別攜帶抗原,清除循環中免疫復合物,增強T細胞依賴反應,效應細胞樣作用,促進吞噬作用以及參與相關的免疫調控過程,是機體免疫系統中的重要組成部分[23]。機體血液中的白細胞包括粒細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)、單核細胞和淋巴細胞。白細胞主要功能是防衛作用。當病菌侵入人體體內時,白細胞能通過變形而穿過毛細血管壁,集中到病菌入侵部位,將病菌包圍﹑吞噬,白細胞數量的變化能影響機體的免疫力[23]。因此,檢測動物外周血紅細胞和白細胞數量變化能說明機體的免疫功能。同時,環磷酰胺是臨床上常用的細胞毒性化療藥物,對骨髓和免疫力具有抑制作用,可以導致血小板和白細胞的降低。由圖2可知,模型組的紅細胞顯著低于空白組(P<0.05),白細胞水平極顯著低于空白組(P<0.05);與模型組相比,CP各劑量組和藥物組均能提高機體中紅細胞和白細胞的水平,其中CP高劑量組和藥物組能顯著提高紅細胞和白細胞水平(P<0.05)。結果表明,CP高劑量組能夠增加經環磷酰胺處理的免疫抑制小鼠中紅細胞和白細胞的數量,具有恢復免疫抑制小鼠的免疫活性。

圖2 CP對免疫抑制小鼠紅細胞和白細胞的影響Fig.2 Effect of CP on red blood cell and white blood cell in immunosuppressed mice

2.3 CP對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-6以及TNF-α水平的影響

在免疫損傷的發生過程中,機體會產生一系列的炎癥反應,貫穿著促炎因子和抗炎因子的相互作用[24]。IL-2是體內重要的抗炎因子,而IL-6和TNF-α是體內重要的促炎因子。IL-2又名T細胞生長因子,能夠促進T細胞增長、誘導干擾素產生、增加細胞增殖和分化的細胞因子以及參加自身免疫性反應的過程[25]。因此,機體中IL-2水平的高低能從一定程度反映出機體免疫力的強弱,在免疫應答中起著很重要的作用。環磷酰胺等免疫抑制劑能抑制IL-2的活性和生成。促炎癥因子IL-6是一種可刺激巨核細胞和巨噬細胞的增殖,可誘導單核細胞趨化蛋白-1的產生及內皮細胞表面粘附分子的表達,從而增強炎癥部位細胞的遷移,加劇炎癥反應[26]。促炎因子TNF-α是由單核-巨噬細胞或其他多種細胞產生的促炎因子,其有雙重的生物學活性,一方面能在機體生理功能、免疫調節以及抗腫瘤等方面有重要作用,另一方面也能參與休克等疾病過程的發生與發展。由圖3A可知,模型組小鼠的抗炎因子IL-2水平極顯著低于空白組(P<0.01),而促炎因子IL-6和TNF-α含量分別顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)高于空白組;另外,與模型組相比,CP各劑量組均能提高IL-2的含量，降低IL-6和TNF-α的含量，其中，CP高劑量組和藥物組能顯著提高因環磷酰胺導致的抗炎因子IL-2含量的降低，顯著降低因環磷酰胺導致的促炎因子IL-6和TNF-α含量的提高(P<0.05)。結果表明，CP高劑量組可以調節小鼠血清中抗炎因子和促炎因子含量，從而發揮免疫調節作用。

圖3 CP對免疫抑制小鼠血清IL-2、 IL-6以及TNF-α水平的影響Fig.3 Effect of CP on serum IL-2,IL-6 and TNF-α levels in immunosuppressed mice

2.4 CP對免疫抑制小鼠遲發型變態反應的影響

遲發型超敏反應(DTH)是細胞介導的免疫在T活化和細胞因子釋放中的重要表現,可通過小鼠足跖腫脹來測量細胞免疫功能[27]。由圖4可知,與空白組相比,模型組的小鼠足跖厚度差顯著降低(P<0.05);CP中、高劑量組與模型組相比足跖厚度差顯著升高(P<0.05),其中CP中劑量組足跖厚度略高于CP高劑量組,究其原因,可能是個別小鼠對SRBC敏感性不夠;CP低劑量組雖升高,但與模型組相比未顯示出明顯的升高;藥物組與模型組相比足跖厚度差極顯著升高(P<0.01)。結果表明,CP中、高劑量組明顯加重小鼠足跖腫脹的差異,以激活機體T細胞參與的相關免疫反應,進一步促進遲發型超敏反應,提高免疫應答,對動物體特異性的細胞的免疫功能有一定的增強作用,也表明CP的免疫調節活性可能與細胞免疫有關。

圖4 CP對免疫抑制小鼠遲發型變態反應的影響Fig.4 Effect of CP on delayed type hypersensitivity in immunosuppressed mice

2.5 CP對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

血清溶血素是體液免疫中重要的指標之一,由于機體B細胞受到抗原刺激后產生相應抗體,該水平反映了抗體生成量的高低。正常的細胞受到雞紅細胞等致敏免疫之后,能產生抗雞紅細胞抗體(溶血素),實驗可檢測樣品上清液的吸光度OD值,從而間接判斷血清抗體生成數量,其中OD值越大,則表明機體產生的抗體數量越多[19]。由圖5可知,與空白組相比,模型組血清溶血素水平極顯著降低(P<0.01);與模型組相比,藥物組和CP高劑量組均能顯著提高血清溶血素的水平(P<0.05),CP低、中劑量組雖然能夠提高血清溶血素水平,但不具有顯著差異。結果表明,CP高劑量組對免疫抑制小鼠的體液免疫功能有一定的增強作用。

圖5 CP對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響Fig.5 Effect of CP on serum hemolysin in immunosuppressed mice

2.6 CP對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響

巨噬細胞是一種多功能免疫細胞,在機體非特異性免疫反應中發揮重要作用。活化的巨噬細胞表現出強的吞噬能力并能分泌大量介質,如IL-2、IL-18、TNF、NO等細胞因子及信號分子,從而發揮抗病毒、抗微生物、抗腫瘤等作用。巨噬細胞功能的強弱能反映機體非特異性免疫能力的狀態,因而巨噬細胞功能檢測被廣泛地運用于臨床研究和體外評價某些藥物對機體的免疫調節作用[28]。由圖6可知,與空白組相比,模型組小鼠巨噬細胞吞噬能力明顯減弱,吞噬率和吞噬指數顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,藥物組和CP組均能夠提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬能力,其中藥物組能極顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(P<0.01),CP中、高劑量組也可以顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬率(P<0.05)，CP各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬指數(P>0.05)。結果表明,CP具有激活、增強免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬異物的能力,促進免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。

圖6 CP對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響Fig.6 Effect of CP on peritoneal macrophage function in immunosuppressed mice注:白細箭頭所指為雞紅細胞;紅中箭頭所指為巨噬細胞; 黃粗箭頭所指為吞噬了雞紅細胞的巨噬細胞。

3 結論

本研究以環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠為模型,探討菊苣多糖提高免疫活性的功能,得出以下結論:CP中、高劑量組對免疫抑制小鼠的凈體重增率、胸腺指數、脾臟指數、吞噬率和吞噬指數均有增強作用,說明CP對免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能有保護作用。CP高劑量組能夠提高免疫抑制小鼠全血中紅細胞和白細胞數量,血清溶血素水平和遲發型超敏反應,說明CP對免疫抑制小鼠的體液免疫和細胞免疫有一定的促進作用。CP高劑量組對免疫抑制小鼠IL-2、IL-6和TNF-α水平有調節作用,使它們趨于正常水平,說明CP對免疫抑制小鼠的細胞免疫功能有一定的提高作用。綜上所述,CP對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫功能有增強作用。