枸杞多糖對LPS誘導BV2小膠質細胞的抗炎活性及NF-κB信號通路的調控作用

馮 晨,于 洋

(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是我國傳統的名貴中藥材,素有“紅寶”美稱,富含植物多糖、蛋白質、維生素等營養成分。現代科學研究顯示,枸杞具有降低血糖、延緩衰老、抗腫瘤、增強免疫力、神經保護等藥理作用,而其藥理特性和生物活性與其主要成分枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)具有很大的相關性[1]。研究發現,LBP在保護視力,免疫調節,抗腫瘤抗衰老,保護神經系統[2]等方面具有重要作用。

中樞神經系統中存在著一種重要的巨噬細胞,被稱為小膠質細胞(microglia,MG),小膠質細胞可處于靜息或激活兩種狀態,在靜息狀態,小膠質細胞沒有吞噬病變組織的能力,但可為神經元分泌多種生長因子,并能夠調節免疫功能;而在激活狀態,輕度激活的小膠質細胞可正常發揮保護神經元的作用,但過度激活的小膠質細胞會釋放出大量的炎癥因子,一定程度上造成炎癥反應加重,從而引起神經元的炎癥損傷[3-4],而神經炎癥是導致神經退行性疾病的主要誘發因素[5]。因此,抑制小膠質細胞過度激活可以減少炎癥因子的分泌,有利于消除神經炎癥,這對治療常見的神經退行性疾病提供了新思路[6]。目前研究結果顯示,LBP在抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的BV2小膠質細胞炎癥因子的釋放方面具有一定的作用。

關于LBP對神經保護作用的機制是研究的熱點,付松等[7-8]在細菌脂多糖誘導的BV2小膠質細胞中發現LBP能經HSP60-TLR-4途徑抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞表達Toll樣受體4(TLR-4)和熱休克蛋白60(HSP60),從而抑制小膠質細胞的活化來發揮神經保護作用。王億龍等[9]觀察了枸杞多糖對放射性腦損傷海馬神經元的保護作用及氧化應激和PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系,發現LBP能夠抑制放射性腦損傷海馬神經元的凋亡,其作用可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路和氧化應激有關,具備神經保護作用,然而LBP在中樞神經系統中的作用及其機制還不清楚。

本研究以BV2小膠質細胞為研究對象,以LPS為激活劑激活靜息狀態的BV2小膠質細胞,以LBP為研究藥劑,進行有關BV2小膠質細胞細胞活力、炎癥因子、細胞中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、NF-κB信號通路的多重實驗,探索LBP的干預對細胞炎癥因子的影響,為神經退行性病變的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞多糖 北京索萊寶科技有限公司，貨號:SP9310純度≥50%;BV2小膠質細胞系 上海生命科學研究院細胞資源中心，貨號:C0147;脂多糖(LPS) 上海研謹生物科技有限公司，貨號Js11060;MTT檢測試劑盒 英國Abcam公司，貨號C0009;ELISA試劑盒(PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α) 上海卓康生物科技有限公司;BCA檢測試劑盒 上海睿時生物科技有限公司，貨號23225;ROS檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司，貨號s0033;鼠抗人p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65、羊抗鼠IgG單克隆抗體 上海博湖生物科技有限公司。

MCO-15AC型CO2培養箱 日本三洋公司;VS-840-1潔凈工作臺 博訊實業(上海)有限公司;DMIL熒光倒置顯微鏡 徠卡顯微鏡(上海)有限公司;Primo R冷凍離心機 德國Heraeus公司;BYC2-24D垂直電泳槽(小型) 美國伯樂公司;UVP GDS-8000紫外凝膠成像系統 美國UVP公司;酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BV2小膠質細胞培養 解凍BV2小膠質細胞,調整細胞濃度為5×104ind/mL,將100 μL細胞懸液接種在含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的IMDM培養基中,37 ℃、5% CO2條件下培養3～4 h至貼壁生長。

1.2.2 分組及給藥 收集生長狀態良好的BV2細胞,計數,將細胞濃度調整至1.0×106～2.0×106ind/mL,然后將細胞按1 mL每孔接種到96孔板。24 h后細胞進入對數生長期,棄培養基,PBS緩沖液漂洗2遍,實驗分為對照組(Control),激活組(LPS),實驗組(200 μg/mL LBP+LPS、400 μg/mL LBP+LPS、600 μg/mL LBP+LPS、800 μg/mL LBP+LPS),每組均設5復孔。對照組添加相應的培養基,激活組添加濃度為1 μg/mL的LPS溶液100 μL,實驗組先用相應濃度LBP預保護1 h,然后再用濃度為1 μg/mL的LPS溶液100 μL共同孵育,均在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.2.3 MTT法檢測LBP對細胞活力的影響 每孔去除培養基,加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL),置于37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養4 h,每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μL,振蕩混勻后用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度(A)值,計算細胞存活率[10]。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子的分泌 收集每孔培養液,按照ELISA試劑盒說明書操作來測定各組培養孔內細胞上清液中炎性因子PGE2、IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平[11]。

1.2.5 H2DCFDA染色結合FCM檢測LBP對LPS誘導的小膠質細胞胞內ROS產生的影響 每孔去除培養基,用終濃度為5 μmol/L的H2DCFDA染液,每孔200 μL染液避光室溫染色30 min。將細胞培養板中的染液收集于流式管,每孔再用100 μL終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細胞30 min,將細胞板中的細胞收集于流式管中,每管加2 μL的PBS將細胞洗滌1遍,1000 r/min,4 ℃離心5 min,棄上清,用200 μL的PBS將細胞重懸,立即用流式細胞儀檢測[12]。

1.2.6 Western Blot檢測各蛋白的表達

1.2.6.1 提取細胞總蛋白 收集細胞,PBS洗滌后,2500 r/min離心10 min。棄上清后用PBS洗滌干凈。加入10 μL磷酸酶抑制劑和2 μL蛋白酶抑制劑,以及200 μL PMSF的裂解液,冰上充分裂解30 min,4 ℃下將裂解液和細胞碎片混合物轉移到離心管中,10000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀于-20 ℃保存。

1.2.6.2 BCA法測蛋白定量 配制標準品溶液(牛血清蛋白)(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL)。96孔板每組3個復孔,分別加入待測樣品與標準品。加入配制好100 μL的BCA工作液(1∶50),在60 ℃環境下反應15 min,酶標儀570 nm波長處檢測吸光度值,根據標準曲線計算出目標樣品濃度。

1.2.6.3 蛋白變性、分離、轉膜和封閉 各組蛋白樣品調整至等濃度上樣,110 V恒壓電泳,待溴酚藍跑出可終止電泳,將蛋白轉移至PVDF膜上。使用5%牛奶室溫封閉活性基團1 h。TBST洗膜3次每次10 min。

1.2.6.4 孵育 加入一抗(鼠抗人p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65單克隆抗體,體積稀釋比1∶1000)4 ℃孵育過夜后,TBST洗膜3次每次10 min。二抗(羊抗鼠IgG抗體,體積稀釋比1∶1000)室溫孵育1 h,洗膜3次每次10 min。

1.2.6.5 顯影 ECL化學發光液顯示,將ECL試劑盒中的A液和B液等體積混勻制成混合液,混合液與PVDF膜表面充分接觸1 min,將膜移至另一保鮮膜上,于暗室進行顯影。采用ImageJ軟件進行光密度分析蛋白條帶定量,并計算相對表達量[13]。

1.3 數據處理

用SPSS 19.0及Origin 5.0統計軟件對數據進行處理比較,數據用Means±SD表示,組間數據對比采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異具有顯著意義。將數據通過Graphpad Prism 7.0繪圖軟件制作成直方圖的形式表現實驗結果之間的差異,通過比較法推測結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 MTT法檢測LBP對細胞活力的影響

采用LPS和不同濃度的LBP分別處理細胞24 h后,LPS組及LBP不同濃度各組的細胞存活率均與對照組比較均無顯著差異(P>0.05),表明LPS和不同濃度LBP對BV2小膠質細胞的活力沒有明顯影響,無明顯細胞度毒性作用,因此,建立在不同濃度梯度的LBP處理后以LPS誘導激活小膠質細胞模型進行相應實驗是可行的,見圖1。

圖1 LBP作用下BV2小膠質細胞的存活率Fig.1 Survival rate of BV2 microglia induced by LBP注:與Contol比較,#P<0.05,與LPS比較, *P<0.05,圖2～圖8同。

2.2 LBP對BV2小膠質細胞分泌炎癥因子的影響

2.2.1 LBP對BV2小膠質細胞分泌炎癥因子TNF-α的影響 經ELISA法檢測,與對照組相比,LPS組細胞上清液中TNF-α含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質細胞分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少更加明顯(P<0.05),說明LBP對小膠質細胞分泌TNF-α起到抑制作用,見圖2。

圖2 LBP對BV2小膠質細胞分泌 炎癥因子TNF-α表達的影響Fig.2 Effect of LBP on the expression of inflammatory factor TNF-α secreted by BV2 microglia

2.2.2 LBP對BV2小膠質細胞分泌炎癥因子IL-1β的影響 經ELISA法檢測,與對照組相比,LPS組細胞上清液中IL-1β含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質細胞分泌IL-1β較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說明LBP對小膠質細胞分泌IL-1β起到抑制作用,見圖3。

圖3 LBP對BV2小膠質細胞分泌 炎癥因子IL-1β表達的影響Fig.3 Effect of LBP on the expression of inflammatory factor IL-1β secreted by BV2 microglia

2.2.3 LBP對BV2小膠質細胞分泌炎癥因子IL-6的影響 經ELISA法檢測,與對照組相比,LPS組細胞上清液中IL-6含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質細胞分泌IL-6炎癥因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說明LBP對小膠質細胞分泌IL-6起到抑制作用,見圖4。

圖4 LBP對BV2小膠質細胞分泌 炎癥因子IL-6表達的影響Fig.4 Effect of LBP on the secretion of inflammatory factor IL-6 by BV2 microglia

2.2.4 LBP對BV2小膠質細胞分泌炎癥因子PGE2的影響 經ELISA法檢測,與對照組相比,LPS組細胞上清液中PGE2含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質細胞分泌PGE2因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說明LBP對小膠質細胞分泌PGE2起到抑制作用,見圖5。

圖5 LBP對BV2小膠質細分泌PGE2因子表達的影響Fig.5 Effect of LBP on the secretion of factor PGE2 by BV2 microglia

2.3 LBP對LPS誘導BV2小膠質細胞細胞內ROS產生的影響

BV2小膠質細胞經H2DCFDA染色后,采用FCM檢測,結果表明,在LPS的誘導下,LPS組小膠質細胞可產生大量ROS,明顯高于Control組(P<0.05)。小膠質細胞經不同濃度LBP處理24 h后,ROS含量較LPS組顯著降低(P<0.05),且降低幅度隨著LBP濃度增加而增加,說明LBP能抑制小膠質細胞中ROS的含量以發揮抗氧化應激作用,見圖6。

圖6 LBP對BV2小膠質細胞分泌ROS含量的影響Fig.6 Effects of LBP on ROS secretion by BV2 microglia

2.4 LBP對NF-κB信號通路的影響

經LBP激活小膠質細胞后,LPS組及不同濃度的LBP組,四種NF-κB信號通路相關蛋白均高于Control組(P<0.05)。但不同濃度的LBP組對應的p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65蛋白表達均低于LPS組,且與LBP濃度成反比,見圖7。研究以LPS誘導激活不同濃度LBP處理過的小膠質細胞,Western Blot檢測細胞質和細胞核內p65蛋白表達,發現細胞質內p65蛋白表達,LPS組和LBP組均顯著低于Control組(P<0.05),且隨著LBP濃度增加而增加;細胞核內p65蛋白表達,LPS組和LBP組均顯著高于Control組(P<0.05),且隨著LBP濃度增加而降低,說明LBP可抑制p65蛋白向核內轉移,見圖8。

圖7 LBP對BV2小膠質細胞NF-κB信號通路中相關蛋白的影響Fig.7 Effect of LBP on the related proteins of NF-kappa B signaling pathway in BV2 microglia

圖8 LBP對BV2小膠質細胞內p65表達情況的影響Fig.8 Effect of LBP on p65 expression in BV2 microglia

3 討論

神經炎癥一般是中樞神經系統(central nervous system,CNS)以及周圍神經系統中出現的神經發炎。其誘因包含多種因素,如物理創傷、化學毒素、病毒感染、缺氧等均可導致神經炎癥的發生,并一定程度造成神經元變性及退化[14]。研究發現,在多種刺激因素作用下,原本處于警戒狀態的小膠質細胞游走至受攻擊的神經元,并黏附在神經元表面。小膠質細胞激活后釋放白細胞介素等多種細胞炎癥因子,產生炎癥反應。過度激活的小膠質細胞釋放更多的炎癥因子,誘導發生神經退行性病變。小鼠腦內IL-1共可分為IL-1α和IL-1β兩種類型,而小膠質細胞構成神經元的外環境,是IL-1β的主要分泌細胞[15]。IL-6是一種全身性炎癥因子,可調節神經系統、免疫系統二者之間的相互作用,是神經系統的主要細胞因子[16]。TNF-α主要來源于單核/巨噬細胞,腦機械性損傷后神經細胞TNF-α蛋白和mRNA增高,大多數學者認為TNF-α有加重繼發性腦損傷的作用[18]。PGE2是一種脂質,能高效調節機體免疫力,研究顯示,PGE2可介導炎癥反應,加重小膠質細胞的激活,分泌更多的炎性IL-1β、TNF-α物質,導致神經元死亡[19]。因此,研究LBP對此四種炎癥因子的抑制效果,可以更好地查明其對小膠質細胞抗炎活性的影響。本研究結果顯示,不同濃度的LBP對由LPS激活的小膠質細胞的典型炎癥因子具有顯著的影響(P<0.05)。四種炎癥因子在LPS的誘導下釋放明顯增多,而經過LBP預處理組,小膠質細胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2四種炎癥因子均較LPS組顯著降低,且隨著LBP濃度的增加而降低。說明LBP能有效的降低小膠質細胞分泌炎癥因子,由此推測可用于治療神經炎癥。

氧化應激是導致神經系統疾病的另一原因,正常情況下,機體的ROS處于動態平衡中,能夠有效地參與細胞活動,但當存在外環境改變導致機體產生過多的ROS時,會產生氧化應激損傷,引起包括神經系統疾病在內的諸多疾病,因此及時有效的清除體內多余的ROS,防治氧化應激帶來損傷是神經系統疾病治療的思路之一。研究發現,多糖具有抗氧化、保護生物膜、延緩衰老、增強抗氧化酶活性、有效清除自由基及抑制脂質過氧化的作用,LBP系多糖,對神經系統有保護作用。LBP可對小鼠視網膜細胞產生影響,經LBP處理能有效減輕氧化應激反應,阻止神經膠質細胞的活化和視網膜神經元死亡,破壞血-視網膜屏障(BRB)[20]。在本研究中,采用不同劑量LBP處理過的小膠質細胞在經LPS激活后,ROS表達在顯著下降(P<0.05),且LBP濃度越高,ROS表達越低,說明LBP能對ROS的激活產生抑制效果。ROS是巨噬細胞在激活時發揮氧化效應的重要物質,激活的小膠質細胞可產生大量的ROS,ROS的蓄積可引起脂肪氧化,蛋白質氧化和DNA損傷,能量代謝衰竭,甚至細胞死亡[21]。本研究中LBP能有效降低激活后小膠質細胞ROS含量,具有抗ROS氧化應激的作用,可能會作為神經退行性病變的治療選擇。

NF-κB是一種影響廣泛的轉錄調節因子,NF-κB轉錄調節因子最早是在哺乳動物細胞中被發現的,并與很多復雜的因子調節存在密切的聯系,尤其是參與到炎癥的調節過程[22]。NF-κB與炎癥反應是一個復雜的過程,具體包括潛伏、誘導、應答及消退4個階段。潛伏階段NF-κB的活化會引起主要包括生長因子的基因、免疫功能、炎癥刺激相關的細胞因子,如白細胞介素基因等諸多基因的表達[23],NF-κB潛伏階段表現為形成p65-p50異二聚體并與IκB結合。誘導階段是NF-κB進入細胞核的過程。當促炎因子較少時進入消退階段,此時 NF-κB的表達也相應減少[24]。轉化生長因子激酶1(Transforming growth factor-β(TGF-β)activated kinase-1,TAK1)、磷酸化TAK1(P-TAK1)是炎癥、免疫、腫瘤等過程中關鍵調控因子,通過多種形式參與NF-κB的活化。在NF-κB信號轉導通路泛素降解途徑使IκB由p65-p50異二聚體解聚,從而激活了NF-κB,調控炎癥基因發生炎癥反應[25]。

本研究采用LPS作為小膠質細胞的激活劑進行神經炎癥造模,經不同濃度LBP處理的小膠質細胞NF-κB信號通路相關因子顯著降低(P<0.05),說明LBP可以有效抑制NF-κB通路的活化,從NF-κB通路激活過程中p65的轉移特點看,經LBP處理的小膠質細胞中p65由細胞質向細胞核轉移情況較未處理的有所降低,LBP濃度越高,這種降低越明顯,也說明NF-κB通路激活受到了抑制,且抑制作用與LBP的濃度相關。作為炎癥反應的重要通路,大量研究已表明,NF-κB參與中樞神經系統疾病的發病過程,研究顯示,IKK抑制劑對中樞神經系統具有保護作用,進一步驗證了NF-κB信號通路在神經退行性病變中發揮作用[26]。本研究中證實了LBP對小膠質細胞NF-κB通路抑制作用,但其具體機制尚需進一步探討研究,因此下一步需要針對小膠質細胞內NF-κB信號通路作用的機制進行研究。鑒于NF-κB信號通路參與了炎癥反應,在本研究中LBP可能通過對NF-κB信號通路的抑制作用實現對炎癥反應的抑制,進而表現出抗炎作用,本研究可為中樞神經系統抗炎治療提供參考。

4 結論

本研究以LPS激活的BV2小膠質細胞為研究對象,探討了枸杞多糖對LPS激活的BV2小膠質細胞有明顯的保護作用,對于LPS激活的BV2小膠質細胞引起的炎癥反應具有抑制作用,可有效抑制LPS刺激后BV2小膠質細胞炎癥因子PGE2、IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放,能抑制小膠質細胞中ROS的含量以發揮抗氧化應激作用,可以有效地抑制LPS刺激后細胞內p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65的表達,提示枸杞多糖可能通過抑制NF-κB信號通路而發揮抗炎癥反應。