柳葉蠟梅醇提物對大黃魚生長、肌肉品質及腸道形態的影響

鄒 永,魏日鳳,黃偉卿,周逢芳,林 珊,鄭世仲,江勝滔,李東東,劉 偉,,*

(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.福建農林大學園藝學院,福建福州 350002; 3.寧德師范學院生命科學學院,福建寧德 352000)

大黃魚(Larimichthyscrocea)又稱黃瓜魚、黃魚、黃花魚等,主要分布在中國的東海、南海、黃海南部的沿海,由于其肉質鮮美,富含豐富的蛋白質和不飽和脂肪酸,廣受人們喜愛,是我國重要的經濟魚之一[1]。隨著人民生活水平的提高,人們對大黃魚的魚肉品質提出了更高的要求。大黃魚多采用集約化網箱養殖,活動空間小,脂肪消耗少,水質不暢,導致養殖大黃魚肉質松散,缺乏咀嚼性,嚴重影響其經濟價值,不利于大黃魚養殖產業未來的發展。鑒于此,人們也在不斷探尋改善魚肉品質的方法。研究表明,溫度[2]、養殖模式[3]、中草藥[4-5]及天然植物提取物[6]對魚肉品質改良有積極作用。其中,植物提取物因其綠色、安全等,同時具備營養性和藥物性特點,越來越受到大黃魚養殖產業的重視。

柳葉蠟梅(Chimonanthussalicifolius),俗稱香風茶、山蠟梅等,是一種較為常見畬族特色藥食同源的草藥,生長在福建壽寧,浙江南部,安徽黃山等地[7]。其主要的活性成分為黃酮和揮發油[8],具有抗氧化、改善腸道健康、降血脂、抑菌消炎等功效[9-12]。柳葉蠟梅的活性成分除了在醫學上得到廣泛研究外,針對水產動物養殖的研究也成為熱點。相關研究表明[6],柳葉蠟梅中的活性物質黃酮類物質和揮發油物有提高魚類生長性能[13]、改善肌肉品質[14-15]、改善腸道形態的功效。但尚未見柳葉蠟梅對魚肌肉品質影響的研究,因此本試驗在大黃魚基礎飼料中添加0%、0.5%、1%、2%、4%柳葉蠟梅醇提物,進行為期8周的養殖試驗,測定大黃魚的生長指標,肌肉的質構,失水率,pH,觀察肌纖維和腸道的微觀形態,并對各個指標進行相關性分析。綜合細致的評價柳葉蠟梅對大黃魚肌肉品質的影響,為今后柳葉蠟梅在水產養殖中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

柳葉蠟梅葉部(ChimonanthusSalicifolius) 由寧德壽寧縣福瑞泰生物技術有限責任公司提供;大黃魚 由寧德市富發水產有限公司提供;石蠟、中性樹膠 購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;蘇木素、尹紅染液 均購自珠海貝索生物技術有限公司;試驗所用飼料 選用“海馬”牌大黃魚人工配合飼料,其產品成分為:粗蛋白≥45.0%,粗脂肪≥6.0%,粗纖維≤5.0%,粗灰分≤14.0%,3.0%≥鈣≥1.0%,總磷≥1.0%,3.0%≥氯化鈉≥0.5%,賴氨酸≥2.8%,水分≤10.0%。

SQP型號電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;EYELA FDU-1200型真空冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;TMS-Pro型質構儀 美國Food Technology Corporation公司;TS-92搖床 其林貝爾有限公司;M199切片刀 徠卡公司;YD-315切片機 浙江金華益迪試驗器材有限公司;BMJ-A包埋機 常州中威電子儀器有限公司;BA210T顯微鏡 Motic公司;DY89-1蓋玻片和AY89-2載玻片 均購于海門元泰有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柳葉蠟梅醇提物醇提物制備 柳葉蠟梅(葉部)采自寧德壽寧縣種植基地,經140 ℃滅酶10 min,80 ℃烘干30 min后粉碎,以7 L/kg的85%乙醇滲漉提取,控制滲漉液流量為4 mL/kg·min[16-17]。所得滲漉液經65 ℃旋轉蒸發后,將濃縮液通過冷凍干燥得浸提粉末,于-20 ℃儲存,備用。

1.2.2 大黃魚飼料制備 將飼料進行粉碎,分別添加0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%柳葉蠟梅醇提物粉末,通過60目篩后,混合加水,用飼料制粒機加工成粒徑為3 mm的軟粒飼料,于烘干機內烘干,后轉至干燥處避光保存,將制作完成的飼料按照柳葉蠟梅醇提物濃度分別標記為L-0(設為對照組)、L-0.5、L-1、L-2、L-4。

1.2.3 試驗魚及飼養管理 試驗用大黃魚(雌雄比1∶1,平均體質量為10.31±2.88 g、平均體長10.21±0.81 cm,26周齡)于2019年9月購買于寧德市富發水產有限公司,試驗于寧德師范學院國家海洋局海西海洋生物種質資源及生物制品開放利用公共服務平臺養殖基地進行,養殖池(長4 m、寬2 m、高2.5 m),經過2周的適應性養殖后,將500尾體質健康平均體質量為10.31±2.88 g、平均體長10.21±0.81 cm的大黃魚幼魚分為5組,每組100尾,每天在9:00和17:00分別按大黃魚體重的2%～3%投喂柳葉蠟梅含量為0%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的軟顆粒飼料。試驗周期8周,養殖期間,保持水體溶氧5 mg/L以上,水溫15～25 ℃,鹽度24.3～27.8,pH7.92～8.23。

1.2.4 樣品采集 養殖結束后,魚體停食24 h,每組隨機撈取10尾魚,稱其重量和體長,去頭去內臟,稱取肝臟和內臟重量,取右側背部采集肌肉樣品(0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm)和1 cm左右的中腸段分成兩份，分別保存于4%多聚甲醛的固定液中用于組織形態分析。再取剩余部分的魚肉,去鱗去鰭,分裝于塑封袋中轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存,備用。另外,每組取10尾魚,在碎冰上致死,立刻取右側背部肌肉(3 cm×1 cm×0.5 cm),平均分成三段分別用于測定肌肉質構、剪切力和pH。取左側背肌(3 cm×1 cm×0.5 cm),均勻分為三段,用于測定失水率。

1.2.5 指標測定方法

1.2.5.1 生長指標及存活率 參照吳金平[18]、謝蘇明等[19]的方法,生長性能相關指標計算公式如下述。

特定生長率(Specific Growth Rate，SGR,%)=(ln終未體重-ln初始體重)÷飼喂天數×100

飼料系數(Feed Conversion Ratio,FCR,%)=攝食量(g)÷[末魚魚重(g)-初魚魚重(g)]

肥滿度(Condition Factor,CF,g/cm3)=末魚重(g)÷末魚魚長(cm)3×100

臟體比(Viscero-somatic Index,VSI,%)=末魚內臟臟重(g)÷末魚魚重(g)×100

肝體比(Hepato-somatic Index,HIS,%)=末魚魚臟重(g)÷末魚魚重(g)×100

存活率(Survival Rate,SR,%)=末魚魚數÷初魚魚數(尾)×100

1.2.5.2 肌肉質構的測定 參照李松等[3]方法,將鮮魚右側背部肌肉,修剪成(1 cm×1 cm×0.5 cm)的規格,用質構儀進行質地剖面測試(textureprofile analysis,TPA),具體參數包括硬度、彈性、咀嚼性、膠粘性及粘附性。測定條件為:探頭型號,P/5;樣品清理時間,1 s;力量感應量程,200 N;回升高度,10 mm;測試速率,10 mm;壓縮形變率,50%;起始力,1.5 N。

剪切力使用燕尾刀片探頭進行試驗,取同上所述的右側背部肌肉,修剪成(1 cm×1 cm×0.5 cm)的規格,然后利用質構儀測定剪切力,記錄最大剪切力。測定條件為:測試速度 50 mm/min,回程距離 30 mm。

1.2.5.3 肌肉系水力的測定 參照許曉瑩[20]的方法,肌肉系水力的測定方法可分為冷藏法、冷凍法和離心法,具體方法如下所述。

冷藏法:取約3.00 g背肌,稱重,置于4 ℃冰箱中24 h,拭去表面水分,稱量末重,冷藏過程中損失的重量與初始重量之比即為失水率。

冷凍法:取約3.00 g背肌,稱重,置于-20 ℃冰箱中24 h,常溫解凍,拭去表面水分,稱量末重,冷凍損失重量與初始重量之比即為冷凍滲出率。

離心法:取約3.00 g背肌,稱重,放入5 mL離心管底部,置于3000 r/min的離心機中離心10 min,拭去表面水分,稱量末重,離心損失重量與初始重量之比即為離心失水率。

1.2.5.4 肌肉pH的測定 結合GB 5009.257-2016及Fuentes等[21]的方法,樣品于4 ℃下放置45 min和24 h后,利用電子天平準確稱取1.00 g背肌肌肉,加入10 mL蒸餾水,利用均質機12000 r/min的轉速均質1 min,制備大黃魚肌肉肉浸液。用pH計的電極充分浸沒到肉浸液中,分別記錄45 min和24 h時肌肉的pH。

1.2.5.5 肌肉及腸道組織結構觀察 參照Periago 等[22]、Johnston 等[23]的方法,將肌肉及腸道樣品置于4%多聚甲醛中固定24 h后取出,分別經70%、85%、90%及100%無水乙醇梯度脫水,置于二甲苯中透明,浸蠟與包埋、切片(6 μm)、展片與烘片、用蘇木精-伊紅染色后封片,用于形態分析。

每處理組均選10尾魚,用顯微鏡對肌肉橫截面拍照,每張切片每個樣品選3個區域拍照10張。用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0來分析肌肉圖片的肌纖維特性。肌纖維直徑通過每張切片至少數300根肌纖維來計算(放大400倍),肌纖維密度通過計算每個視野內(放大400倍)的肌纖維數,換算得出單位面積得肌纖維密度,取平均值作為每個重復試驗肌肉纖維的測定數據。

每處理組均選擇10尾魚進行觀察統計(放大100倍),每張切片選取6根正常無損傷的腸絨毛進行長度、寬度、隱窩深度得測量,并計算絨毛長度與隱窩深度之比,取平均值作為每個重復試驗魚腸道形態的測定數據。

1.3 數據處理

所有指標數據均用WPS 2020進行分析處理,數據采用“平均數±標準誤”表示,使用SPSS 23 統計軟件進行單因素方差分析(ANOVA),差異顯著用Duncan’s多重比較進行,顯著性水平為0.05。相關性分析采用SPSS 23進行Pearson和Two-tailed進行比較。

2 結果與分析

2.1 柳葉蠟梅對大黃魚生長性能及存活率的影響

由表1可以看出,柳葉蠟梅醇提物對大黃魚的特定生長率、肥滿度、肝體比與臟體比無顯著影響。投喂柳葉蠟梅醇提物L-0.5、L-1、L-2、L-4組分存活率顯著高于L-0組(P<0.05)。可見柳葉蠟梅醇提物能夠提高大黃魚的存活率。此外,柳葉蠟梅不會對大黃魚的生長性能產生不良影響,為其作為大黃魚飼料提供了一定理論基礎。

表1 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚生長的影響(平均值±標準差,n=10)Table 1 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extracts on growth performance of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

表2 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚質構的影響(平均值±標準差,n=10)Table 2 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extracts on muscle physical characteristics of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

天然植物近期被廣泛用于魚類養殖的研究。一方面,天然植物提取物被驗證具有較好的生理活性如促進動物生長[24]。鄧超準[25]研究表明,食用含有葡萄籽原花青素的飼料后星洲紅魚增重率和特定生長率均有顯著提高,其濃度800 mg/kg添加到飼料中時效果最佳。另一方面天然植物提取物具有一定的藥性,能夠改善魚類的健康情況,提高免疫力[5],進而提高存活率。楊繼華等[26]研究發現,飼料中添加桑葉黃酮提高了吉富羅非魚機體抗氧化指標,并降低了亞硝酸鹽應激條件下吉富羅非魚的死亡率。曲木等[5]試驗表明,飼料中添加0.2%和0.4%黃芪、黨參、野菊花(5∶3∶2)復方中草藥,黃顙魚免疫力顯著強于對照組(P<0.05)。本試驗結果表明,柳葉臘梅醇提物對大黃魚生長性能無顯著影響,存活率顯著提高,與楊繼華等[26]的研究類似。生長性能結果存在差異的原因可能是與飼料濃度,選取柳葉蠟梅部位,大黃魚產地,海水來源有關,具體有待進一步探索。存活率提高可能是由于柳葉蠟梅醇提物與桑葉黃酮有相似的效果,通過提高機體抗氧化性和免疫能力,進而提高對外界不良環境的抵御能力,提高存活率。

表3 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚肌肉系水力的影響(平均值±標準差,n=10)Table 3 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extracts on water holding capacity of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

2.2 柳葉蠟梅對大黃魚質構的影響

由表2所示,柳葉蠟梅醇提物對大黃魚的硬度、內聚力、膠粘性及咀嚼性均有一定影響。與L-0組相比,L-1、L-2、L-4組的硬度、膠粘性顯著提高(P<0.05);L-2、L-4組內聚力則顯著提高(P<0.05);L-4組的咀嚼性顯著相較于其他組分顯著提高(P<0.05)。各組間剪切力與L-0比較有所下降,但差異則不顯著。

質構是食品重要的品質特性之一,在肉質品質評價中廣泛應用[27-28]。本試驗結果表明,濃度為4.0%的柳葉蠟梅醇提物能夠顯著提高大黃魚肌肉的硬度、內聚力、膠粘性和咀嚼性。由此可知,柳葉蠟梅醇提物對大黃魚的肌肉品質的改善可能表現在,口感更硬實,更有咀嚼性,抵抗外力的能力變強等幾個方面。

2.3 柳葉蠟梅對大黃魚系水力的影響

如表3所示,所有組分失水率均要高于離心失水率和冷凍滲出率。L-4組的失水率和冷凍滲出率均顯著低于L-0(P<0.05)。各組間離心失水率無顯著差異。

系水力是指當肌肉受外力作用時仍保持原有水分的能力,包括失水率、冷凍滲出率、離心失水率等[29],是重要的肉品質指標之一。水分的損失會造成水溶性蛋白[30]、可溶性風味物質[31]和肌肉中血紅素的流失,進而影響肌肉品質。吳姝等[32]研究表明,植物黃酮類物質能顯著降低黃羽肉雞肉的失水率,與本試驗的結果類似,說明柳葉蠟梅醇提物也有類似的效果。此外,當柳葉蠟梅醇提物含量為4.0%時,魚肉冷凍滲出率顯著下降(P<0.05)。因此,柳葉蠟梅醇提物可能是通過提高大黃魚冷藏和冷凍過程中的系水能力,減少可溶性蛋白和風味性物質的流失,進而改善大黃魚的肌肉品質。

表4 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚肌肉pH的影響(平均值±標準差,n=10)Table 4 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extract on pH of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

表5 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚肌肉纖維形態的影響(平均值±標準差,n=10)Table 5 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extract on muscle quality of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

2.4 柳葉蠟梅對大黃魚pH的影響

結果如表4所示,肌肉放置45 min時,L-1、L-2、L-4組分pH要顯著高于L-0組(P<0.05),L-4組肌肉的pH最高且顯著高于其他組分(P<0.05)。肌肉放置24 h后,且各組間pH差異顯著(P<0.05)。L-0.5、L-1、L-2、L-4的pH下降率均低于L-0的下降率,且差異顯著(P<0.05)。

魚體死亡后,肌肉糖原無法進行有氧分解,只能通過糖酵解反應生成乳酸,同時,三磷酸腺苷為無氧酵解提供能量,分解產生磷酸等酸性物質促使肌肉pH下降[33-34],導致肌肉水分滲出增多,蛋白質變性,營養價值降低[35]。本試驗結果表明,柳葉蠟梅醇提物能顯著降低肌肉pH下降率(P<0.05)。同時,相關性分析表明,pH下降率與冷凍滲出率呈顯著正相關,相關系數為0.581。由此推測,柳葉蠟梅能夠降低肌肉pH下降率進而改善冷凍滲出率,提高肌肉的水分,并可能減少蛋白質變性,對肌肉品質的提升產生積極的作用。

2.5 柳葉蠟梅對大黃魚肌纖維結構的影響

如圖1所示,L-0組和L-0.5組的肌肉纖維直徑較大,雖存在直徑較小的肌纖維但數量較少。而在L-1、L-2和L-4中小直徑的肌肉纖維數量增多。如表5所示。L-1、L-2和L-4組分的肌纖維直徑顯著低于L-0組(P<0.05)。綜上所述,隨著柳葉蠟梅含量的提高,肌纖維的直徑變小。試驗組的肌纖維密度相較于L-0,變化均顯著增加(P<0.05)。

肌纖維的組織學特征常用于肉質的評價,肌纖維的數量和大小分布是決定魚肉質地特性(如硬度、彈性、粘結性、口感)的重要因素。一般來說肌纖維直徑越小、密度越大的品種,其肌間脂肪沉積較多,肌肉的口感較好[36-37];肌纖維密度越大,肉質越鮮嫩[38]。但目前關于柳葉蠟梅對魚肉的影響尚處空白。本試驗結果表明,柳葉蠟梅醇提物不僅能降低肌纖維直徑,而且能提高肌纖維的密度,從微觀的結構上看能夠改善魚肉的品質。

圖1 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚肌肉纖維形態的影響Fig.1 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extracts on muscle quality of Larimichthys crocea

2.6 柳葉蠟梅對大黃魚腸道結構的影響

如表6、圖2所示。L-2和L-4組分絨毛長度,隱窩深度及絨毛長度與隱窩深度之比與L-0存在顯著差異(P<0.05),濃度越高,絨毛越長,隱窩越淺,二者比值越高。各組間的腸壁厚度和絨毛寬度則無顯著差異(P>0.05)。

一般而言,腸道絨毛長度和寬度越大其吸收營養物質的面積就越大;隱窩越淺絨毛上皮細胞成熟度越好,分泌功能越好[39];絨毛長度與隱窩深度之比綜合反映小腸絨毛吸收功能,比值越高,消化吸收功能越強[40]。本試驗結果表明4.0%的柳葉蠟梅醇提物能顯著提高絨毛長度(P<0.05),柳葉蠟梅濃度為2.0%和4.0%的組分還顯著提高了絨毛長度與隱窩深度之比(P<0.05),由此推測,柳葉蠟梅對腸道形態的影響有助于營養物質的吸收。

表6 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚腸道形態的影響(平均值±標準差,n=10)Table 6 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extracts on intestinal morphology of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

圖2 柳葉蠟梅醇提物對大黃魚腸道形態的影響Fig.2 Effects of Chimonanthus salicifolius aleoholic extract on intestinal morphology of Larimichthys crocea(Mean±SD,n=10)

2.7 相關性分析

柳葉蠟梅醇提物濃度與各指標的相關性如表7所示,柳葉蠟梅醇提物濃度與硬度、內聚力、膠粘性、絨毛長度的相關系數分別為0.719、0.786、0.667、0.865,呈極顯著正相關(P<0.01);濃度與咀嚼性、肌纖維密度、離心失水率的相關系數分別為0.531、0.623、0.520,呈顯著正相關(P<0.05);濃度與肌纖維直徑相關系數為-0.686,呈極顯著負相關(P<0.01);濃度與失水率相關系數為-0.524,呈顯著負相關(P<0.05)。在試驗濃度范圍內,隨著柳葉蠟梅的濃度增高,大黃魚肌肉硬度、內聚力、膠粘性、咀嚼性、絨毛長度,肌纖維密度有一定的提高;而隨著濃度增高,肌纖維直徑變小。由此可知,柳葉蠟梅濃度與大黃魚的肌肉品質,腸道絨毛和肌肉形態改變有關。

表7 柳葉蠟梅醇提物濃度與肌肉品質和腸道形態的相關性分析Table 7 Correlation analysis of Chimonanthus salicifolius aleoholic extract concentration with muscle quality and intestinal morphology

大黃魚的質構是決定大黃魚口感的最直觀因素。質構與其他指標的相關性如表8所示。硬度、內聚力與肌肉纖維長度呈極顯著負相關;膠粘性和咀嚼性與肌纖維直徑呈顯著負相關。相關研究也表明,肌纖維直徑越短,面積越小,密度越大肌肉硬度越高[36-37]。同時,本研究結果發現剪切力與肌纖維密度呈顯著負相關(P<0.05)。這與王巍等[41]研究結果一致,其結果表明肌纖維密度和剪切力呈負相關。剪切力又與嫩度有關,剪切力越小嫩度越高[42]。綜上可知,高濃度柳葉蠟梅可能通過改善肌肉纖維的直徑和密度,進而改善肌肉的質構。

本研究發現硬度和咀嚼性與失水率顯著負相關(P<0.05)。何麗娜[28]的研究發現,水分與魚肌肉質地呈負相關,水分越低硬度越高。賈艷華等[43]也在研究水分含量對扇貝軟烤質構的影響時發現,硬度隨著水分含量的下降而顯著增大(P<0.05),而彈性則隨之減小,失水率越大,肌肉水分含量越低。在本試驗中,L-4組能夠顯著降低大黃魚肌肉的失水率(P<0.05),進而改善口感,其機理可能與失水率降低,肌肉硬度提高有關。

此外,相關性研究表明,絨毛長度與內聚力呈顯著正相關關系(P<0.05),隱窩深度與膠粘性呈顯著負相關關系(P<0.05)。由此可知,添加2.0%和4.0%柳葉蠟梅醇提物的組分能夠改善大黃魚腸道形態,促進營養物質的吸收,進而改善大黃魚肌肉的品質。其原因可能與營養物質吸收有關,相關機理有待進一步探索。

表8 肌肉質構與系水力、pH下降率肌纖維和腸道形態的相關性分析Table 8 Correlation analysis of muscle texture with water power,pH decline rate of muscle fiber and intestinal morphology

3 結論

柳葉蠟梅醇提物對大黃魚的存活率、質構、肌肉系水力、肌纖維形態和腸道形態均能產生一定的影響。當添加量為4.0%時,大黃魚的存活率、硬度、內聚力、膠粘性、咀嚼性、pH下降率、肌纖維密度、腸道絨毛長度、絨毛與隱窩比均顯著提高;失水率、冷凍滲出率、肌纖維長度、腸道隱窩深度均顯著下降。相關性分析表明柳葉蠟梅醇提物的作用效果與其濃度有關,濃度越高效果越顯著。同時,肌纖維形態,腸道形態,肌肉系水力與肌肉質構存在一定相關性。柳葉蠟梅對大黃魚肌肉品質的提高可能是通過改善腸道形態,促進營養物質的吸收,進而改變肌纖維的形態、提高大黃魚肉質的口感。本試驗結果說明,柳葉蠟梅醇提物對大黃魚的肉質有一定的改善作用,為柳葉蠟梅今后在水產養殖中的應用提供一定理論基礎。但目前相關研究還處于基本階段,相關的機理有待進一步探索。