高壓均質協同殼聚糖萃取對乳清水中大豆蛋白結構和功能性的影響

李朝陽,竇中友,顧新禹,陳 尚,郭增旺

(1.黑龍江八一農墾大學,國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319; 2.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心,黑龍江大慶 163319; 3.黑龍江八一農墾大學,食品學院,黑龍江大慶 163319; 4.遜克縣農場學校,黑龍江北安 164423; 5.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

圖1 乳清水殘留大豆蛋白回收工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of whey water residual soybean protein recovery

大豆是豆科大豆屬一年生草本植物,含有豐富的優質蛋白、不飽和脂肪酸、礦質元素及B族維生素,它是居民膳食中優質蛋白質的重要來源。大豆蛋白質含量約為35%～40%,氨基酸比例均衡,富含谷類蛋白質缺乏的賴氨酸,可與谷類蛋白質互補。大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)作為一種營養豐富的蛋白類食品添加劑[1],具有良好的溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性等功能特性[2]。大豆分離蛋白的提取方法主要包括堿溶酸沉法、超濾法和離子交換法,基于成本和效益的考慮,國內外常用的提取方式為堿溶酸沉法。研究發現,堿溶酸沉法提取大豆蛋白過程中會產生大量的大豆乳清水又被稱為廢水,其約含1.5%～2.5%的固形物,富含大豆蛋白質及大豆低聚糖[3]。為達到環保要求需對產生的廢水進行后續處理,這嚴重增加了大豆蛋白的生產成本,限制產業化發展。

為絮凝沉淀大豆乳清水中蛋白質主要是采用多糖絮凝法,但普遍存在絮凝沉淀效率低等問題。利用高黏度殼聚糖(黏度>400 mPa·s)回收魚糜漂洗液中的蛋白質,結果表明:當pH6.5、溫度20 ℃、作用時間90 min、殼聚糖質量濃度1.67 mg/mL時,高黏度殼聚糖對魚糜漂洗液中蛋白質回收率達43.68%[4];Huang等[5]利用殼聚糖回收大豆蛋白,得出蛋白回收的最佳條件為pH6.0～6.5,蛋白/殼聚糖比例4∶1,溫度25 ℃,凝聚產率大于60%;劉秉濤等[6]研究發現在不同pH條件下,殼聚糖回收粗蛋白的效果差異顯著。迄今為止,殼聚糖是絮凝沉淀廢液中蛋白質常用的一種方法,其原理在于它是一種天然陽離子型聚電解質高分子化合物,在蛋白生產中與帶負電的蛋白質發生靜電相互作用形成相對穩定的復聚物[7]。譚慧等[8]研究發現SPI-多糖混合體系在高壓均質作用下蛋白質部分功能特性得到顯著改善(P<0.05)。高壓均質技術是一種廣泛應用在食品與藥品方面的加工技術,其利用撞擊力、空穴爆炸力、剪切力等作用力,將乳濁液或懸浮液均質成微乳液[9-10]。高壓均質協同殼聚糖界面復聚效應處理廢液是否能提高蛋白回收率及其對回收蛋白結構和功能性質的影響,目前尚缺乏系統研究。

本研究利用高壓均質協同殼聚糖技術處理大豆乳清水回收殘留大豆分離蛋白,并研究該技術對回收蛋白的結構和功能特性的影響,為工業化生產大豆分離蛋白廢水的處理和副產物資源化利用提供了理論及實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆乳清水(乳清蛋白0.5%(血球凝集素和7S球蛋白90.0%)、大豆低聚糖0.9%、黃酮類物質0.2%) 實驗室自制;殼聚糖(脫乙酰度91.8%;黏度45 mPa·s;相對分子質量31000 Da)、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250 sigma公司。

FB-110T超高壓均質機 上海勵途機械設備工程有限公司;CR22G型高速冷凍離心機 日本日立公司;FJ200-S型高速勻漿機 力辰科技有限公司;RF-5301PC型熒光分光光度計、UV-2600紫外分光光度計、PE Raman Station 400型激光顯微拉曼光譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清水殘留大豆蛋白回收

操作要點:取500 mL大豆乳清水在25 ℃下,按照0、30、60、90、120 MPa等五個水平分別處理10 min;將一部分均質后大豆乳清水的pH調至6.0(2 mol/L NaOH),按乳清水/殼聚糖質量比2∶1分別加入殼聚糖,室溫(25 ℃)下攪拌1.5 h;將均質后大豆乳清水和蛋白/殼聚糖混合溶液4 ℃條件10000×g離心30 min,沉淀水洗2～3次,調pH至7.0。同樣條件再離心20 min,得上清液;將離心得到的蛋白/殼聚糖混合溶液上清液調節pH至9.0,攪拌過夜后靜置,部分的殼聚糖會因為不溶而形成沉淀,同樣條件再離心30 min,得上清液;將上述所得溶液調pH至7.0,離心30 min,冷凍干燥得蛋白[11-12]。采用Bradford法[13]測定回收蛋白的蛋白含量。

1.2.2 回收蛋白回收率測定 為避免回收蛋白中存在游離氨基酸和其它一些具備還原性質的化合物對蛋白含量測定結果的干擾,利用Bradford法[13]分別測定初始液蛋白濃度(乳清水)及經不同方式處理后上清液蛋白濃度,并計算蛋白回收率。

蛋白回收率(%)=(初始液蛋白濃度-上清液蛋白濃度)/初始液蛋白濃度×100

按照上述方法分別繪制0.1～1.0和0～0.1 mg/mL蛋白含量標準曲線。蛋白質含量標準曲線分別為y=0.81187x+0.00045,R2=0.99932;y=7.85247x+0.08185,R2=0.99946。其中y為吸光值,x為蛋白質濃度。從決定系數R2來看,線性關系良好。本試驗中以500 mL酸沉清液回收蛋白為標準計算回收蛋白的回收率。

1.2.3 拉曼光譜分析 利用pH7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品配制成100 mg/mL溶液,按照王中江的方法進行拉曼光譜測定[14]。

1.2.4 熒光光譜分析 回收蛋白樣品0.25 g/100 mL(0.1 mol/L磷酸鹽pH7.0),室溫(25 ℃)下溶解,避光保存。激發波長為290 nm,激發和發射的狹縫5 nm,掃描波長300～400 nm,恒定掃描速度240 nm/min,電壓500 mV[15]。

1.2.5 表面疏水性測定 將所得樣品溶于0.01 mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液中,配成2 mg/mL的蛋白溶液,按照Wang等[16]的方法進行表面疏水性的測定。

1.2.6 濁度測定 將蛋白樣品配制成3 mg/mL,參照許琳霜等[17]的方法進行蛋白溶液濁度測定。

1.2.7 溶解性測定 參考Samoto等[18]方法進行蛋白質溶解性的測定。

1.2.8 乳化活性及乳化穩定性測定 將回收蛋白樣品溶液配制成2 mg/mL,參考Tang等[19]方法進行蛋白乳化活性及乳化穩定性的測定。

1.3 數據分析

試驗處理均為3次平行,差異顯著性采用SAS 8.2軟件進行統計分析,并采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 回收蛋白含量結果

高壓均質組和高壓均質協同殼聚糖組回收蛋白含量如表1所示,隨均質壓力增加,高壓均質組和高壓均質協同殼聚糖組蛋白含量均逐漸增加,但當均質壓力大于60 MPa時,高壓均質組和高壓均質協同殼聚糖組回收蛋白含量無顯著增加(P>0.05),且高壓均質組(壓力大于60 MPa)和高壓均質協同殼聚糖組無顯著差異(P>0.05)。

表1 不同均質壓力下回收蛋白含量Table 1 Contents of recovered protein under different homogenous pressures

2.2 均質壓力對殘留大豆蛋白回收率影響

不同高壓均質壓力對蛋白回收率的影響如圖2所示,隨高壓均質壓力增加,蛋白回收率總體上呈現出先增加后下降的趨勢。對空白組(沒添加殼聚糖,僅高壓均質處理)言時,大豆蛋白的回收率隨均質壓力增加先增加后減小,當均質壓力90 MPa時取得最大的蛋白回收率。這是由于高壓均質處理使蛋白分子空間結構發生變化,疏水基團暴露導致表面疏水性增加,從而增加了蛋白的回收率。但繼續增加高壓均質壓力(120 MPa)會導致蛋白質發生一定程度上變性,蛋白表面疏水性下降,使得蛋白回收率下降[20]。當高壓均質協同殼聚糖處理時,在相同均質壓力下,隨著殼聚糖添加量增加,蛋白回收率明顯增加。這可能是由于隨著殼聚糖用量的增大,蛋白和殼聚糖之間的相互作用增強,使得蛋白回收率增加。基于此選擇蛋白/殼聚糖質量比為2∶1。當均質壓力從0 MPa升高到90 MPa,高壓均質協同殼聚糖處理的蛋白回收率顯著增加(P<0.05),由43.01%上升到 61.92%,繼續增大壓力,回收率開始出現輕微的下降,且與單獨添加殼聚糖回收蛋白相比(即高壓均質壓力0 MPa),高壓均質(90 MPa)協同殼聚糖處理使蛋白含量增加了43.96%。這種現象產生的原因可能是由于強剪切作用使蛋白質分子有一定程度的解離和伸展,從而導致大量極性基團暴露,表面電荷增加,蛋白疏水基團與殼聚糖間的靜電相互作用不斷加強,從而形成有效蛋白復凝聚[21]。但隨著高壓均質壓力(120 MPa)的不斷增大,蛋白質發生聚集作用,從而減弱了與蛋白-殼聚糖間的相互作用,影響了大豆蛋白的回收率[10]。

表2 回收蛋白的二級結構表(%)Table 2 Secondary structure of recovered protein under different homogenous pressure(%)

圖2 不同高壓均質壓力蛋白回收率Fig.2 Recovery rate of protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一蛋白/殼聚糖質量比, 不同均質壓力之間數據差異顯著(P<0.05)。

2.3 拉曼光譜分析

不同高壓均質壓力條件下回收的蛋白在酰胺Ⅰ帶(1630～1700 cm-1)拉曼光譜峰的結構歸屬為:α-螺旋在1645～1660 cm-1,β-折疊在1665～1680 cm-1,β-轉角在1680～1690 cm-1,無規則卷曲在1660～1670 cm-1。酰胺Ⅰ帶的拉曼特征峰代表回收蛋白二級構象,未C=O與C-N鍵的伸張[22]。如表2所示,隨高壓均質壓力逐漸增加,高壓均質及高壓均質協同殼聚糖處理回收蛋白的α-螺旋和β-折疊結構含量先減少后增多,且兩組均在均質壓力90 MPa時取得最小值,但無規卷曲結構含量先增加后減少。這可能是由于均質處理使大豆分離蛋白內部弱氫鍵和分子間作用力裂解,蛋白質分子結構變化,導致其有序結構含量下降[23]。隨高壓均質壓力繼續增加到120 MPa后,強剪切力對蛋白分子內部隱藏的疏水基團進行切割,從而導致大量疏水性基團暴露,蛋白質分子間通過相互形成新的化學鍵,造成蛋白質分子的有序性增加。從總體來看,與高壓均質處理組相比,高壓均質協同殼聚糖處理組的有序結構α-螺旋和β-折疊含量更多。這種現象說明乳清水中的殘留蛋白可能與殼聚糖形成了部分聚合穩定的蛋白網絡結構,證明高壓均質協同殼聚糖界面復聚效應使蛋白質二級結構更趨有序化[24]。

2.4 熒光發射光譜分析

從圖3可以看出,在290 nm激發波長下,峰位在波長325～350 nm之間,因此該熒光發射光譜可能為色氨酸殘基。高壓均質處理使得回收蛋白的λmax和熒光強度均發生了顯著的改變。當均質壓力達到90 MPa時,回收蛋白的熒光強度和λmax增加,當均質壓力大于120 MPa后,λmax開始下降。這可能是由于高壓均質處理使大豆蛋白分子發生部分解折疊,結構伸展,致使色氨酸殘基暴露于蛋白質分子表面[25]。但是當均質壓力達到一定的值后,回收蛋白變性程度增加,結構緊密,包裹在蛋白內部的活性基團增加[26]。此外還可以看出,高壓均質協同殼聚糖處理后,回收蛋白的熒光強度顯著降低,這可能是與殼聚糖對色氨酸殘基的屏蔽作用有關,減少了其與熒光猝滅物質的反應,導致回收蛋白的熒光強度下降[27]。

圖3 不同均質壓力下回收蛋白熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of recovered protein under different homogenous pressures

2.5 表面疏水性分析

不同均質壓力對回收蛋白表面疏水性的影響如圖4所示。回收蛋白的表面疏水性隨著均質壓力的增加而顯著上升,這是由于高壓均質處理使蛋白質分子空間結構發生變化,疏水基團部分逐漸暴露出來,表面疏水性開始逐漸增加[22]。當均質壓力為120 MPa時,高壓均質組回收蛋白的表面疏水性迅速增加,這主要是由于更大均質壓力產生的強剪切力對蛋白質內部的隱藏的疏水性基團進行切割,導致回收蛋白的表面疏水性大幅增加[25]。總體來看,與高壓均質組相比,復合處理后回收蛋白的表面疏水性降低,多糖對蛋白質中賴氨酸和精氨酸殘基等疏水性基團具有屏蔽了作用,回收蛋白質的親水性增加,導致表面疏水性降低[28]。

圖4 不同均質壓力下回收蛋白表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of recovered protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一處理不同均質壓力之間 數據差異顯著(P<0.05)。

2.6 溶解度及濁度分析

如圖5所示,隨均質壓力增加回收蛋白的溶解性不斷升高,但當均質壓力達到90 MPa時,其增加速度隨著壓力的繼續升高而逐漸減小;回收蛋白溶液的濁度逐漸減少,且與溶解性的變化趨勢相反。推測原因可能是:在高壓均質作用下回收蛋白質的顆粒減小,比表面積增加,改善了其溶解性。此外,蛋白顆粒在高壓均質條件下易趨于穩定的懸浮液,導致溶液濁度降低[26-27]。同時相同均質壓力處理條件下,高壓均質協同殼聚糖組具有更好的溶解性,且濁度更小。這可能是由于添加殼聚糖引入了親水性基團,增加了蛋白分子的水合作用,使得回收蛋白的溶解性增加,濁度減小[11]。

圖5 不同均質壓力下回收蛋白濁度和溶解度Fig.5 Turbidity and solubility of recovered protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一指標不同均質壓力之間 數據差異顯著(P<0.05)。圖6同。

2.7 乳化活性及乳化穩定性分析

蛋白的乳化活性和乳化穩定性與蛋白質的結構、溶解度、表面疏水性和表面電荷分布密切相關[20]。如圖6所示,隨高壓均質壓力增加(0～120 MPa),回收蛋白乳化活性及乳化穩定性逐漸增加,但變化趨勢逐漸減小。這是由于高壓導致蛋白質發生空間結構變化,使埋藏在蛋白質分子內部的疏水性基團暴露出來,導致其疏水性增加,有利于改善蛋白質的親水/疏水平衡,降低了界面張力,改善蛋白質乳化性[29]。隨著均質壓力(120 MPa)的增加,高剪切作用不斷加強使埋藏的疏水性基團更多的暴露出來,蛋白顆粒減小,使得表面疏水性和單位蛋白的可吸附界面面積顯著增加(P<0.05),從而改善乳化活性[30]。與高壓均質組相比,高壓均質協同殼聚糖處理乳清水的回收蛋白具有較好的乳化活性和乳化穩定性。這可能是由于引入的親水性殼聚糖結合到蛋白質分子的側鏈上,增加了其親水性,而且多糖鏈也抑制了油相的聚集,回收蛋白更容易在油/水界面上分散排列,具有較好的乳化活性和乳化穩定性[31]。

圖6 不同均質壓力下回收蛋白乳化特性Fig.6 Emulsifying properties of recovered proteins under different homogeneous pressures

3 結論

本文主要通過高壓均質協同殼聚糖界面復聚效應回收堿溶酸沉乳清水中殘留大豆蛋白,研究該處理方法對殘留蛋白回收率,并深入研究該技術對回收蛋白結構(二級、三級結構)及功能特性的影響。研究發現當乳清水/殼聚糖質量比2∶1,高壓均質壓力不大于90 MPa時,與單獨添加殼聚糖處理相比,高壓均質協同殼聚糖處理顯著(P<0.05)提高了蛋白回收率,并改善了回收蛋白的部分功能性質。高壓均質處理改變回收蛋白分子的構象和色氨酸殘基微環境的極性,使蛋白內部活性基團發生變化,顯著提高了蛋白的表面疏水性及溶解性、濁度、乳化活性和乳化穩定性。根據高壓均質對殘留蛋白回收率及其對回收蛋白功能性質的改善,選擇高壓均質壓力為90 MPa,乳清水/殼聚糖質量比2∶1。每處理1噸大豆乳清水可回收蛋白4 kg,具有顯著的經濟效益,此外本技術的研究可以有效解決大豆乳清廢水的環境污染問題,具有良好的社會效益。本研究為工業化生產大豆分離蛋白廢水的處理和副產物資源化利用提供了理論及實踐基礎。