熊果酸對H22荷瘤小鼠抗腫瘤及腸道細菌群落結構多樣性的影響

田 力,萬端靜,邱丹纓,溫揚敏,*

(1.泉州醫學高等專科學校基礎醫學部,福建泉州 362000; 2.泉州市中醫院,福建泉州 362000)

細菌不僅分布于人體皮膚表面以及口鼻腔、腸道、泌尿生殖道等與外界相通的各種腔道,少量細菌還能穿過胃腸黏膜而暴露于腸肝循環,甚至進入血液循環[1]。細菌可通過直接作用、分泌代謝物和調節免疫等途徑影響各種腫瘤的發生發展,據估計,約13%的腫瘤與細菌感染有關[2]。肝癌是最常見腫瘤之一,腸道細菌失調能影響宿主膽汁酸代謝,引發肝臟炎癥,促進肝癌發生[3]。研究表明,通過干預腸道菌群能改善腫瘤療效[4]。

熊果酸是藤梨根、車前草及女貞子等抗腫瘤中藥的有效活性成分,在臨床實踐中獲得廣泛應用[5]。熊果酸能通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移、逆轉放化療藥物的耐藥性、抑制腫瘤血管生成和調節免疫等機制發揮抗腫瘤作用,對肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌以及肝癌等多種癌癥具有抑制作用[6]。但關于熊果酸對腫瘤患者腸道菌的研究鮮有報道,本文以皮下接種H22肝癌細胞構建移植瘤小鼠模型為對象,基于16S rDNA技術研究熊果酸對H22肝癌小鼠抗腫瘤及腸道細菌的影響,以期為熊果酸抗腫瘤機制研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熊果酸 上海麥克林生化科技公司,純度98%,枇杷(Eriobotryajaponica)葉提取物,用于醫藥、化妝品;小鼠糞便DNA提取試劑盒 promega公司。小鼠T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8)試劑盒 上海仁捷公司;小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α))、白細胞介素-2(IL-2)試劑盒 北京四正柏公司。

JY300C電泳儀 北京六一儀器廠;Multiskan FC酶標儀 賽默飛(北京)公司;WD-9413C型光凝膠成像分析系統 北京六一生物公司;Veriti 96 PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組及飼養 SPF級昆明小鼠(北京華阜康公司,許可證號:SCXK(京)2019-0008),24～26 ℃,12 h晝夜交替適應性飼養一周后,根據文獻方法制備H22肝癌實體瘤模型[7],正常對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。根據文獻和預實驗確定小鼠用藥劑量。小鼠隨機分6組,每組8只。分別為正常組(N):正常小鼠灌胃生理鹽水;模型組(M):腫瘤小鼠灌胃生理鹽水;陽性對照組(C):腫瘤小鼠灌胃50 mg/kg環磷酰胺;熊果酸低劑量組(UL):腫瘤小鼠灌胃50 mg/kg熊果酸;熊果酸中劑量組(UM):腫瘤小鼠灌胃100 mg/kg熊果酸;熊果酸高劑量組(UH):腫瘤小鼠灌胃200 mg/kg熊果酸;實驗始末記錄體重,每天給藥1次,連續3周。

1.2.2 指標檢測 末次給藥24 h后,首先收集單只小鼠糞便,然后稱體重。接著摘眼球取血,分別根據小鼠T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8)試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-2(IL-2)試劑盒說明書檢測血清T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-2(IL-2)濃度。最后頸椎脫臼處死小鼠。取小鼠肝臟和脾臟、剝取瘤組織稱重,計算肝脾指數和抑瘤率。

肝脾指數(%)=肝脾重(mg)/體重(g)×100

抑瘤率(%)=[(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100

1.3 腸道菌分析

1.3.1 DNA的提取、PCR擴增及高通量測序 每組小鼠糞便隨機選4個樣品,按試劑盒說明書提取DNA,進行腸道菌群分析。以小鼠糞便DNA為模板,采用文獻中的引物[8]擴增16S rDNA的V3-V4 區。擴增體系為:12.5 μL Phusion Hot start flex 2X Master Mix,上下游引物各2.5 μL,模板DNA50 ng,加水至25 μL。擴增條件為:95 ℃預變性2 min,隨后98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環,最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經過純化后使用Qubit對文庫進行定量。將合格的文庫(濃度應在2 nmol/L以上)進行上機測序(由杭州聯川生物公司完成)。

1.3.2 生物信息學分析 首先對測序原始讀數據進行質控、過濾等處理以獲得高質量的clean data。接著使用ASVs(Amplicon Sequence Variants)的概念構建類OUTs(Operational Taxonomic Units)。基于OUTs結果,用QIIME2[9]計算Chao1、Observed species、Goods coverage、shannon、Simpson等α多樣性指數,并進行主成分分析(PCA,Principal Component Analysis)。使用SILVA(Release 132,https://www. arb-silva. de/documentation/release-132/)以及NT-16S數據庫做物種分類及后續分析(數據分析由聯川生物公司協助完成),作圖使用聯川公司提供R包云工具實現的。

1.4 統計學方法

2 結果與分析

2.1 熊果酸對肝癌移植瘤的影響

表1 熊果酸對臟器指數和抑瘤率的影響Table 1 Effect of ursolic acid on organ index and tumor inhibition

陽性對照藥物環磷酰胺(CTX)是一種廣譜抗腫瘤藥物,但具有明顯毒副作用,能引起食欲不振、惡心、體重下降等不良反應[10]。從表1可以看出,雖然陽性對照組(CTX)能顯著抑制腫瘤生長,抑瘤率達68.71%,但小鼠體重、肝脾指數均比模型組顯著降低(P<0.05),顯示明顯毒副作用。而熊果酸各劑量組小鼠體重、肝脾指數與模型組差異不顯著(P>0.05),表明熊果酸對腫瘤小鼠無明顯毒副作用。熊果酸各劑量組腫瘤質量均比模型組顯著降低(P<0.05),其中高劑量組和中劑量組腫瘤質量與模型組差異極顯著(P<0.01),高劑量組抑瘤率最高達37.81%。顯示熊果酸對H22肝癌具有良好抑制效果,與姚宏斌等[7]結論一致。

圖1 稀釋曲線(A)和Alpha多樣性指數(B)Fig.1 Rarefaction curve(A)and Alpha diversity index of OTUs

2.2 熊果酸對小鼠血清細胞因子的影響

T細胞參與免疫應答的負調節及在自身免疫耐受中發揮作用。IL-2具有活化T細胞,促進細胞因子產生、刺激自然殺傷細胞(NK)細胞增殖、促進B細胞增殖和分泌抗體等活性[11]。環磷酰胺在殺傷腫瘤細胞的同時對機體正常細胞產生損害,降低巨噬細胞的吞噬能力,NK和T淋巴細胞增殖能力等,能顯著抑制機體免疫活性[10]。與以上結論相似,本研究結果顯示環磷酰胺(陽性對照組)T細胞亞群和IL-2含量均比正常組顯著降低(P<0.05)。

李艷紅等研究發現,熊果酸能增強淋巴細胞增殖能力,促進血清IL-2、TNF-α表達,熊果酸的抗腫瘤作用與提高機體的免疫能力有關[12]。從表2看出,與正常組比較,模型組小鼠T細胞亞群和IL-2含量極顯著降低(P<0.01)。熊果酸各劑量組小鼠T細胞亞群和IL-2含量均比模型組高,其中中劑量組和高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05),顯示熊果酸能提高腫瘤小鼠免疫活性。TNF-α對腫瘤細胞具有細胞毒性,而且是介導細菌感染免疫應答的一個重要因素[13]。從表2可以看出,模型組小鼠血清TNF-α含量比陽性對照組顯著減小(P<0.05),熊果酸各劑量組TNF-α含量比模型組顯著增加(P<0.05),其結果與方學輝等[14]研究結果一致。

表2 熊果酸對小鼠血清細胞因子的影響Table 2 Effect of ursolic acid on the level of cytokine in

2.3 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌影響

2.3.1 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌群多樣性分析 24個樣本共獲得4938個OTUs,所有樣品稀釋曲線均趨于平穩(圖1A),顯示測序量已經達到飽和。Alpha多樣性指數是反映一個特定區域或生態系統內物種豐富度和均勻度的綜合指標[15]。與正常小鼠比較,模型組小鼠腸道細菌chao1指數、shannon值和simpson指數減小(圖1B),其中chao1指數和shannon值差異顯著(P<0.05),顯示腫瘤造模使小鼠腸道細菌的豐度和多樣性減小,其結果與甄宏德等關于原發性肝癌小數腸道菌α多樣性指數減小一致[16]。熊果酸各劑量組腸道菌α多樣性指數與模型組比較差異不顯著(P>0.05),表明熊果酸對腫瘤小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度無顯著影響。

Beta多樣性是不同生態系統之間多樣性的比較,反映樣品間是否具有顯著的微生物群落差異,可通過主成分分析(Principal component analysis,PCA)等方法反應樣本之間的差異。PCA圖中樣本之間距離越接近,物種組成越相似。從圖2可以看出,6組小鼠細菌相似性差異顯著(P<0.05)。PCA顯示,與正常組比較,模型組和熊果酸低劑量組小鼠腸道細菌群落差異顯著(P<0.05),而熊果酸中劑量組和高劑量組小鼠細菌群落與對照組差異不顯著(P>0.05。表明正常組與模型組之間小鼠腸道細菌相似性差異較大,熊果酸能影響小鼠腸道細菌群落結構,其中熊果酸中、高劑量組對腫瘤引起的腸道細菌菌群紊亂具有改善和恢復作用。

圖2 主成分分析Fig.2 Principal component analysis

2.3.2 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌門水平影響 腸道細菌構成一個復雜的微生態系統,可通過與腫瘤直接接觸,調節機體免疫和調節機體代謝等途徑影響腫瘤的發生、發展和治療[17]。研究表明,小鼠腸道菌群的兩大主導菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes),與未消化食物代謝有關[18]。與以上結論相似,本實驗6組樣本共包括10個門,擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌門(圖3),各組實驗小鼠擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度均超過85%。

圖3 門水平微生物種類分布圖Fig.3 The microbial composition at phylum level

疣微菌門一些細菌在宿主的免疫刺激和代謝信號傳導過程中發揮重要作用[19]。研究表明,腫瘤引起人和動物腸道菌群結構顯著改變,如早期肝癌患者疣微菌門(Verrucomicrobia)細菌比健康人群明顯減少[20]。與正常組比較,模型組小鼠腸道細菌擬桿菌門、厚壁菌門和疣微菌門豐度均差異顯著(P<0.05),其中模型組擬桿菌門豐度比正常組增加41.03%,厚壁菌門和疣微菌門豐度分別比對照組減少43.24%和60.77%(P<0.05)。與模型組比較,熊果酸各劑量組擬桿菌門相對豐度均有所減少,其中熊果酸中高劑量組差異顯著(P<0.05)。熊果酸中高劑量組小鼠厚壁菌門和疣微菌門豐度比模型組增加,其中疣微菌門豐度差異顯著(P<0.05)。顯示熊果酸各劑量組菌群在門水平的比例和分布更接近正常組,表明熊果酸對腫瘤小鼠腸道細菌菌群結構具有正向的調節作用。

2.3.3 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌科水平影響 24個樣品共包括56個科。Muribaculaceae菌群與復雜碳水化合物的降解有關,約占小鼠腸道菌群的一半[21],與以上結論一致,各組小鼠中Muribaculaceae豐度最高(約45%～60%)。在急性肝衰竭小鼠中豐度顯著增加,提示Muribaculaceae與肝衰竭及其并發癥的發病機制有關[22]。從圖4可以看出,模型組小鼠Muribaculaceae豐度比對照組顯著增加(P<0.05),而熊果酸各劑量組Muribaculaceae豐度均比模型組減少,其中熊果酸中、高劑量組差異顯著(P<0.05)。毛螺菌科(Lachnospiraceae)能發酵膳食纖維產生的短鏈脂肪酸(SCFA),具有降低腸道炎癥反應、提高粘膜屏障等功能[23]。與對照組比較,模型組小鼠毛螺菌科豐度比對照組顯著減少(P<0.05),熊果酸各劑量組毛螺菌科豐度與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。Giorgia等[24]研究發現,瘤胃菌科(Ruminococcaceae)豐度較高癌癥患者的生存時間顯著高于瘤胃菌科豐度較低的患者,腸道瘤胃菌科細菌可能通過激活免疫系統來增強抗腫瘤反應。模型組小鼠瘤胃菌科豐度比對照組顯著減少(P<0.05),而熊果酸各劑量組瘤胃菌科豐度均比模型組顯著增加(P<0.05)。表明腫瘤造模后小鼠腸道菌在科水平發現顯著改變。與模型組比較,熊果酸能減少Muribaculaceae等豐度,而提高毛螺菌科和瘤胃菌科等豐度,使小鼠腸道菌群在科水平比例和分布更加接近于正常組,表明熊果酸對模型小鼠腸道細菌菌群紊亂具有一定恢復作用。

圖4 科水平微生物種類分布圖Fig.4 The microbial composition at family level

圖5 屬水平微生物種類分布(A)及菌群差異分析(B)Fig.5 The composition at genus level(A)and difference analysis of intestinal flora(B)

2.3.4 差異菌分析 從24個樣品中共鑒定出167個屬。從圖5A可知,正常組小鼠腸道細菌優勢屬Akkermansia、Bacteroides、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG-014、Muribaculum,而模型組小鼠腸道細菌優勢屬為Muribaculum、Bacteroides、Akkermansia、Alistipes、Paramuribaculum,表明腫瘤能引起小鼠腸道細菌屬水平發生變化。與模型組比較,熊果酸低、中、高劑量組小鼠腸道細菌水平相對豐度分布更接近正常組,顯示熊果酸能影響腫瘤小鼠腸道細菌屬水平分布。

為分析熊果酸對腫瘤小鼠腸道菌影響,對不同實驗組之間差異菌群進行兩兩比較(圖5B)。Akkermansia屬能維持消化道健康,降低肥胖、糖尿病、炎癥等疾病的風險。Akkermansia屬中的Akkermansiamuciniphila被稱為新抗癌明星細菌,能增加癌癥免疫治療效果上,減緩小鼠衰老速率,延長生存壽命[25]。本研究顯示,模型組小鼠腸道菌Akkermansia屬豐度比正常組極顯著減小(P<0.01),而熊果酸中高劑量組小鼠腸道菌Akkermansia屬比模型組極顯著增大(P<0.01)。關于熊果酸對小鼠腸道菌Akkermansiamuciniphila的影響,以及熊果酸增加Akkermansiamuciniphila豐度與抗腫瘤關系有待進一步研究。

乳酸菌(Lactobacillus)是一種常見益生菌。研究表明,乳酸菌可通過抑制腸道中的致癌物質、調節機體免疫和誘導細胞凋亡等途徑發揮抗腫瘤作用[26]。Intestinimonas可能與多種疾病相關,糖尿病和肥胖患者,重金屬鎳中毒者腸道菌Intestinimonas豐度顯著減少[27]。圖5所示,模型組小鼠Lactobacillus和Intestinimonas豐度比對照組極顯著下降(P<0.01),熊果酸各劑量組小鼠腸道Lactobacillus和Intestinimonas豐度比模型組極顯著增加(P<0.01),表明熊果酸能提高腫瘤小鼠腸道有益菌的比例。Muribaculum與冠心病、糖尿病和應急焦慮等疾病相關。劉程鵬等研究表明,糖尿病小鼠Muribaculum豐度增大,給小鼠灌胃功能食品后Muribaculum豐度減少[28]。與以上結論相似,本研究結果顯示腫瘤小鼠腸道菌Muribaculum比對照組極顯著增大(P<0.01),熊果中高劑量組能極顯著降低腫瘤小鼠Muribaculum豐度(P<0.01)。

環磷酰胺(CTX)是常見的免疫抑制劑,能引起腸道菌群乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌豐度,導致腸道菌群紊亂[29]。與以上結論一致,本研究結果顯示環磷酰胺陽性對照組Lactobacillus豐度比對照組和模型組均極顯著減少(P<0.01)。Daillère等[30]研究發現,CTX可以驅使腸道菌群中的Enterococcushirae和Barnesiellaintestinihominis激活脾臟中T細胞的抗癌免疫應答,顯著提高CTX的抗腫瘤效果。本研究結果顯示,陽性對照組Barnesiella豐度比模型組極顯著增加(P<0.01),關于環磷酰胺抗腫瘤與腸道菌關系有待進一步研究。

3 結論

熊果酸廣泛分布于熊果、梔子、山楂、濕生蕾、女貞子、車前草、毛子草等植物中,具有抗腫瘤、降血糖、抗瘧疾、消炎抗菌、肝損傷的保護等多種生物學效應,其中以抗腫瘤作用為主。熊果酸還具有毒副作用小、自然界資源豐富等優勢,具有廣闊的開發應用前景,有望成為一種高效低毒的抗腫瘤新藥[31]。本研究通過分析熊果酸對H22肝癌小鼠腸道菌群的影響,顯示熊果酸各劑量組腫瘤質量均比模型組顯著降低(P<0.05),熊果酸各劑量組小鼠T細胞亞群和IL-2含量均比模型組高,其中中劑量組和高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05),顯示熊果酸能增強腫瘤小鼠免疫活性,抑制腫瘤生長。

熊果酸能改變了小鼠腸道細菌組成,在門水平上,與正常組比較,模型組小鼠擬桿菌門豐度顯著增加,而厚壁菌門顯著減少(P<0.05)。在科水平,模型組小鼠Muribaculaceae豐度比正常組顯著增加(P<0.05),而毛螺菌科和瘤胃菌科等豐度比對照組顯著減少(P<0.05)。熊果酸各劑量組腸道細菌在門水平和科水平的比例和分布均比模型組更接近正常組。熊果酸還能增加Akkermansia和Lactobacillus等有益菌豐度,表明熊果酸能改善腫瘤小鼠腸道細菌菌群結構,對腫瘤模型小鼠腸道細菌菌群紊亂具有一定恢復作用。熊果酸的抗腫瘤作用可能與改善腸道菌群有關,其相關機制有待進一步研究。